一种姬松茸菌株ZJJSR001及其栽培方法与流程

一种姬松茸菌株zjjsr001及其栽培方法
技术领域
1.本发明属于食用菌技术领域，具体涉及一种姬松茸菌株zjjsr001（中菌姬松茸1号）及其栽培方法。


背景技术：

2.姬松茸（agaricus blazei）是一种珍稀食药用菌，它在真菌分类学上属于担子菌门、伞菌目、蘑菇科、蘑菇属，中文别名：巴西蘑菇。原产于美国、巴西等地，由美国真菌学家w.a.murrill首次发现。人工栽培始于日本，并按照日本人喜爱的松茸而命名为“姬松茸”。1992年，我国引进了该菌种，并在国内首次栽培成功，而后推广到全国各地。
3.姬松茸的菇体滑爽脆嫩，口感极好，味纯鲜香，具有浓郁的杏仁香味，其营养丰富，含有丰富的蛋白质、氨基酸和矿质元素，食用价值颇高。同时姬松茸还富含多糖、活性核酸、活性缁醇类以及抗肿瘤的外源凝集素等活性物质，具有降血脂、降血糖、降低低密度脂蛋白，对中风、心肌梗死、肾功能不全、神经痛及癌症具有一定辅助治疗作用。因此，姬松茸受到广大消费者的喜爱，近年来在全国范围内广泛栽培，栽培面积和规模不断扩大，发展潜力巨大。
4.目前，国内姬松茸栽培菌种主要来自日本引进菌株，栽培菌株较为单一。针对不同的栽培环境及栽培基料等存在着适应性差、产量低、抗杂性差、商品性状差等问题。因此，针对国内的栽培环境选育优良的姬松茸新菌株及新品种，对姬松茸种质资源的优化和加强我国的种质资源自主建设是极其重要的。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的是提供一种姬松茸菌株zjjsr001，本发明的第二目的是提供姬松茸菌株zjjsr001的栽培方法。
6.本发明的第一目的是这样实现的，一种巴西蘑菇菌株（agaricus blazei）zjjsr001，命名为“中菌姬松茸1号”，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.40129，保藏日期为2022年4月18日。
7.本发明的第二目的是这样实现的，所述姬松茸菌株zjjsr001的栽培方法，具体步骤如下：1）固体原种制备：将活化的姬松茸菌株zjjsr001接种到固体原种培养基中，23-27℃培养25-30天得到固体原种；2）栽培种制备：将装有栽培种培养基的栽培袋于121℃下灭菌2.5h，待冷却至25℃以下，将步骤1制备的固体原种进行接种，接种量为8-10g/袋, 封好口，置于培养室23-27℃下恒温避光培养，培养30-40d后，菌丝长满菌袋且成熟变浓白后，进行播种栽培。
8.本发明的有益效果是：本发明提供了一株具有优异商品特性和产业化利用价值的姬松茸新菌株
zjjsr001（中菌姬松茸1号），其与亲本fa菌株（姬松茸abml11）相比，具有产量高、商品性状好、子实体营养物质含量高及生长速度快且抗性强的特点，具体如下：1、姬松茸菌株zjjsr001的产量为14-16kg/m2，每亩产量约为10-10.7t，远高于其亲本fa菌株的10-12 kg/m2，每亩产量约为7.5-8t；姬松茸菌株zjjsr001的生物学效率约为40%-45%，较其亲本fa菌株约30%-35%的生物学效率明显提高。
9.2、姬松茸菌株zjjsr001与亲本fa菌株相比子实体大，单菇重，菌柄上下均匀，一致性好，特别在第二潮菇后尤其明显。
10.3、姬松茸菌株zjjsr001的子实体总糖含量是亲本fa菌株的1.8倍 ；维生素b2是亲本菌株fa的1.6倍；维生素c是亲本菌株fa的2.8倍；烟酸是亲本菌株fa的2.6倍；总烟酸是亲本菌株fa的1.6倍。
11.4、在15℃、20℃、25℃、30℃的温度条件下，姬松茸菌株zjjsr001的生长速度均快于亲本的fa菌株，长满平皿时间短；在相同条件下，姬松茸菌株zjjsr001对青霉、木霉的抗性表现更强。
附图说明
12.图1为姬松茸菌株zjjsr001与亲本fa菌株的系统发育树；图2的上、下图分别为亲本fa菌株和姬松茸菌株zjjsr001的ssr片段峰值图；图3为姬松茸菌株zjjsr001（a图）和亲本fa（b图）的菌丝生长情况；图4为两株姬松茸菌株对木霉（a图）、青霉（b图）的抗性实验结果图，其中，图a和图b的上、下图分别为亲本fa菌株与姬松茸菌株zjjsr001；图5为姬松茸菌株zjjsr001的原种生长情况图；图6为两株姬松茸菌株的出菇子实体图，其中，a图为姬松茸菌株zjjsr001，b图为亲本fa菌株；图7为姬松茸菌株zjjsr001的出菇图。
具体实施方式
13.下面结合附图与实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
14.本发明提供了一种巴西蘑菇菌株（agaricus blazei）zjjsr001，于2022年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.40129。
15.本发明还提供了所述姬松茸菌株zjjsr001的栽培方法，具体步骤如下：1）固体原种制备：将活化的姬松茸菌株zjjsr001接种到固体原种培养基中，23-27℃培养25-30天得到固体原种；2）栽培种制备：将装有栽培种培养基的栽培袋于121℃下灭菌2.5h，待冷却至25℃以下，将步骤1制备的固体原种进行接种，接种量为8-10g/袋, 封好口，置于培养室23-27℃下恒温避光培养，培养30-40d后，菌丝长满菌袋且成熟变浓白后，进行播种栽培。
16.步骤1中，所述原种培养基由以下重量份的原料组成：棉籽壳90-94份, 麦麸4-6份, 过磷酸钙0.8-1.2份, 碳酸钙0.8-1.2份, 石灰0.8-1.2份；所述原种培养基的含水量
为55-65%。
17.步骤2中，所述栽培种培养基由以下重量份的原料组成：麦粒96-98份, 石膏粉2-4份；所述栽培种培养基的含水量50%-55%，ph自然。
18.栽培料二次发酵结束后，当料温降至28℃以下时，进行播种。
19.本发明还提供了一种鉴定姬松茸菌株zjjsr001与亲本fa菌株（姬松茸abml11）的ssr分子标记，所述分子标记为引物b5，引物b5的上游引物序列为：5
’‑
cgcatcttgggctcctt-3’；下游引物序列为：5
’‑
ggggaagcacgatcgtt-3’。
20.本发明中两株姬松茸菌株的来源如表1所示：表1 两株姬松茸菌株来源信息本发明中姬松茸新菌株zjjsr001经过形态学与分子生物学鉴定，确认为蘑菇科、蘑菇属的姬松茸（agaricus blazei）；并使用ssr引物b5可以将姬松茸新菌株zjjsr001与亲本fa菌株进行区分，两个菌株遗传背景具有明显的差异。
21.本发明姬松茸菌株zjjsr001（于2022年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏编号为cgmcc no.40129。
22.实施例l 姬松茸菌株zjjsr001的获得采摘七成熟的姬松茸zjjsr001菌株的子实体，去除土壤及培养料，表面使用75%的酒精进行消毒，放入超净工作台中；用干净的解剖刀将子实体纵切，取菌柄及菌盖中部的组织放在灭过菌的pda平皿中；将平皿置于25℃恒温避光放置3-7d，即可获得姬松茸zjjsr001的菌丝（图1）。
23.实施例2 姬松茸zjjsr001菌株形态及分子鉴定姬松茸菌株zjjsr001的形态特征如下：子实体大，多群生，菇形好，子实体高7.36-8.74cm，鲜重17.19-30.17g；菌盖浅褐色，直径3.40-7.40cm，菌盖高2.48-2.76cm；菌柄白色，长4.88-5.80cm, 菌柄上下围均一，粗短充实，近正圆柱形，菌柄直径（上）14.07-18.03mm，菌柄直径（下）18.99-20.59mm，菌柄直径上下差4.56-5.86mm。
24.姬松茸菌株zjjsr001的分子鉴定：将供试的菌株转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃培养5-7d后收集菌丝；采用擎科 tsp101-200试剂盒提取菌丝的基因组dna，用琼脂糖凝胶电泳法和生物分光光度计法检测dna的纯度和浓度。使用its 通用引物its4、its5进行pcr扩增。25μl扩增体系包括：金牌mix(green，擎科 tse101)20ul、0.5μmol/l 上下游引物、50ng 基因组模板dna。pcr 扩增程序为：94℃2min；94℃15s、60℃30s、72℃60s、30个循环；72℃10min。pcr完成后，加6
×
上样缓冲液5μl 混匀，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。检测合格后，进行测序。将获得的its序列，使用blast软件在ncbi数据库进行同源性比对，与数据库中已有的姬松茸的各个菌株相应序列一致性（identities）都达到99%。同时，从数据库下载蘑菇属物种和裂褶菌（schizophyllum commune）的its序列，且使用mega7软件构
建nj系统发育树，使用默认参数，bootstrap检验为1000次。由图1，可以看出姬松茸zjjsr001菌株与fa菌株与姬松茸的its序列聚为一枝，且支持率为99%。综合，以上结果可以得出结论姬松茸zjjsr001菌株为蘑菇科、蘑菇属的姬松茸（agaricus blazei）。实施例3 姬松茸zjjsr001栽培将棉籽壳92份, 麦麸5份, 过磷酸钙12份, 碳酸钙1份, 石灰1份加水混合，得到含水量为60%的原种培养基。将活化的姬松茸菌株zjjsr001接种到固体原种培养基中，25℃培养25-30天得到固体原种；再将97份麦粒加水浸泡5h后，煮熟，捞出沥水后，使其含水量为55%，拌入3份石膏粉，调节至ph自然得到栽培种培养基；在栽培袋内装入栽培种培养基，封口后 于121℃下灭菌2.5h，待冷却至25℃以下，将固体原种进行接种，接种量为8-10g/袋, 封好口，置于培养室25℃下恒温避光培养，培养30-40d后，菌丝长满菌袋且成熟变浓白后，进行播种栽培。
25.姬松茸栽培料需要经过二次发酵后才可用于后续的栽培。栽培料配方为甘庶渣39份, 玉米芯39份, 干牛粪16份, 过磷酸钙1.5份, 石灰1.5份, 石膏1.5份, 碳酸氢铵1.5份, 含水量60%。
26.首先，进行第一次发酵。将各个原材料摊在地面，撒上石灰，反复洒水喷湿或用1%石灰水反复喷水预湿，让料充分吸足水分后，沥去多余水分，使其含水量达65%。牛粪采用边淋水、边翻拌的方法预湿，闷堆24h后，使其含水量达60%, 待建堆时加入；将各个原材料充分混合进行建堆发酵。在整个发酵过程中一般要翻堆3 ~ 4次，发酵后，培养料色泽为棕褐色，无氨味、无臭味、无酸味，培养料含水量为65% ~ 70%。培养料手抓有弹性，用力一拉即断，并有一种特殊的香味，ph值以8为宜。
27.栽培料的二次发酵。将前发酵的培养料均匀堆制在培养架上，厚度以20 ~ 25cm为宜。关闭门窗，通过蒸汽加热增温，使培养料温度达到60 ~ 65℃, 保持8~12h进行巴氏消毒，进一步杀虫杀菌，然后通风降温，使料温维持在48 ~ 55℃, 保持4~6d, 进行控温发酵，促进堆内产生大量嗜热放线菌，释放出水解酶，继续分解，使培养料完全分解。
28.栽培料二次发酵结束后，当料温降至28℃以下时，采用撒播方法播种，每平方米播种栽培种750ml的瓶子1瓶。播种后，进行发菌管理，播种25 ~ 30d, 待菌丝可长满培养料，及时覆土。覆土时先覆粗土，厚度为2 ~ 3cm，再覆细土，细土厚度为0.5~1.0cm, 以填平粗土粒空隙为宜。覆土2d内，用清水分数次将土壤润湿，原则是少喷勤喷，保持土层湿润，土壤含水量约60%。覆土后15~20d, 当覆土层绒毛状菌丝逐渐变成细索状，部分菌索交叉处开始扭结膨大，出现白色小米粒状原基时，应重喷一次出菇水，喷水要均匀、细小，喷后加大通风。以后每天轻喷水1~2次保持土层湿润，无白心；通风2~3次，室内空气湿度保持在85% ~90%; 控制菇房的温度为20 ~ 25℃。
29.实施例4 姬松茸zjjsr001栽培将棉籽壳90.6份, 麦麸6份, 过磷酸钙1.0份, 碳酸钙1.2份, 石灰1.2份加水混合，得到含水量为65%的原种培养基。将活化的姬松茸菌株zjjsr001接种到固体原种培养基中，25℃培养25-30天得到固体原种；再将96份麦粒加水浸泡5h后，煮熟，捞出沥水后，使其含水量为50%，拌入4份石膏粉，调节至ph自然得到栽培种培养基；在栽培袋内装入栽培种培养基，封口后于121℃下灭菌2.5h，待冷却至25℃以下，将固体原种进行接种，接种量为8-10g/袋, 封好口，置于培养
室25℃下恒温避光培养，培养30-40d后，菌丝长满菌袋且成熟变浓白后，进行播种栽培。
30.其他步骤同实施例3.实施例5 姬松茸zjjsr001栽培将棉籽壳93.6份, 麦麸4份, 过磷酸钙0.8份, 碳酸钙0.8份, 石灰0.8份加水混合，得到含水量为55%的原种培养基。将活化的姬松茸菌株zjjsr001接种到固体原种培养基中，25℃培养25-30天得到固体原种；再将98份麦粒加水浸泡5h后，煮熟，捞出沥水后，使其含水量为55%，拌入2份石膏粉，调节至ph自然得到栽培种培养基；在栽培袋内装入栽培种培养基，封口后于121℃下灭菌2.5h，待冷却至25℃以下，将固体原种进行接种，接种量为8-10g/袋, 封好口，置于培养室25℃下恒温避光培养，培养30-40d后，菌丝长满菌袋且成熟变浓白后，进行播种栽培。
31.其他步骤同实施例3。
32.实施例6利用ssr分子标记鉴别姬松茸zjjsr001菌株与fa菌株（1）dna提取将2个供试的菌株转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上，25℃培养5-7d后收集菌丝；采用擎科 tsp101-200试剂盒提取菌丝的基因组dna，用琼脂糖凝胶电泳法和生物分光光度计法检测dna的纯度和浓度。
33.（2）ssr引物引物b5：5
’‑
cgcatcttgggctcctt-3’和5
’‑
ggggaagcacgatcgtt-3’（3）pcr扩增pcr扩增体系为：总体积20ul，包括：擎科tse101-金牌mix(green) 16.45ul，10 μm tag dna酶 1.2ul，10umol/l ssr标记正向引物和反向引物各1.2ul，模板dna 1ul。pcr 反应条件：98℃ 2 min; 98℃ 10 second，60℃ 10 second，72℃ 10 second，35个循环；72℃ 5 min。为保证鉴定的准确性，进行三次重复实验。
34.（4）将扩增产物进行毛细管电泳检测：将abi hidi formamide缓存液与genescan 500liz size standard内标试剂按130：1混合，配成mix；用96孔反应板分装mix，每个孔中加入10ul mix；对应着在96孔板中加入0.5ul样品模板，离心到4000 rpm即停；用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20℃；冷却后拿出，4000 rpm离心，解冻、混匀；使用3730测序仪进行毛线管电泳，加样量为2ul样品和6ul溴酚蓝，电压为300v，时间12分钟。
35.（5）结果鉴定由图5的毛细管电泳检测的峰值图可以看出，亲本fa菌株的扩增片段大小为138bp，而zjjsr001菌株的扩增片段大小为186bp。由此说明，姬松茸zjjsr001菌株与亲本fa菌株的遗传背景具有明显的差异。
36.实验例1姬松茸zjjsr001菌株与亲本fa菌株母种生长及抗性比较1、生长速度测定测定方法：将生长在pda培养基平皿上的姬松茸zjjsr001菌株（与亲本fa菌株用1cm的打孔器打孔，后置于新的pda培养基平皿上进行温度梯度生长实验。设置4个温度梯度分别为15℃、20℃、25℃、30℃，每个梯度4个重复，培养一定时间测量生长速度。
37.表2 不同温度梯度下zjjsr001菌株与亲本fa菌株的生长速度统计结果：从表2中可以看出，在15℃、20℃、25℃、30℃的温度条件下，姬松茸菌株zjjsr001的生长速度均快于亲本的fa菌株，长满平皿时间短。
38.2、抗性检测检测方法：首先将生长在pda培养基平皿上的姬松茸zjjsr001菌株、亲本fa菌株、青霉、木霉用直径为1cm的打孔器打孔。后置于新的pda培养基平皿上，新的pda培养基一侧为姬松茸菌株，另一侧青霉或木霉。每个抗性实验3个重复，培养一定时间测观察生长情况。
39.结果：由图2可以出去，姬松茸zjjsr001菌株相对于亲本fa菌株来说，对青霉和木霉具有更明显的拮抗线，说明姬松茸zjjsr001菌株的抗性更强。
40.实验例2 姬松茸zjjsr001菌株与亲本fa菌株原种生长比较测量方法：将生长在pda培养基平皿上的姬松茸zjjsr001菌株与亲本fa菌株接种到原种固体培养基中。每个培养瓶接种1个90mm长满菌丝的平皿，每个菌株各接种14瓶。置于25℃培养室，恒温避光培养，培养一定时间测量生长速度。测量时，横向与纵向各测量一次。
41.表3 姬松茸zjjsr001菌株原种生长信息统计表4 姬松茸fa菌株原种生长信息统计
结果：从表3与表4可以看出，姬松茸zjjsr001菌株无论是前期生长速度、后期生长速度、平均生长速度都快于亲本的fa菌株，姬松茸zjjsr001菌株长满固体原种瓶的时间整体比fa菌株4天左右，且长势较好。
42.实验例3 姬松茸zjjsr001菌株与亲本fa菌株的子实体农艺性状比较方法：按照实施例3栽培方法分别栽培zjjsr001和亲本fa菌株，按照不同出菇潮次采集姬松茸zjjsr001菌株与亲本fa菌株子实体进行测量。
43.表5 姬松茸zjjsr001菌株与亲本fa菌株的子实体农艺性状信息统计结果：从表5可以看出，姬松茸zjjsr001菌株子实体大，单菇重，菌柄上下均匀，一致性好，商品性状好，特别在第二潮菇后尤其明显，zjjsr001菌株的平均产量16kg/m2远高于fa菌株的12kg/m2（图4与图5）。
44.实验例4 姬松茸zjjsr001菌株与亲本fa菌株的营养成分比较方法：按照实施例3栽培方法分别栽培zjjsr001和亲本fa菌株，收集姬松茸zjjsr001菌株与亲本fa菌株的第二潮次出菇的子实体，带回实验室，热风干燥后进行营养成分的测定。两株姬松茸菌株的栽培料、培养环境条件等保持一致。
45.总糖测定参照gb 5009.8-2016《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》；粗多糖测定以sn/t 4260-2015《进出口行业标准 出口植物源食品中粗多糖的测定》为参照；蛋白质含量测定参照gb 15673-2009《国家标准 食用菌中粗蛋白含量的测定》；粗纤维含量测定参照gb 5009.10-2003《国家标准 植物类食品中粗纤维的测定》；氨基酸的测定参照gb 5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》；单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸和总不饱和脂肪酸测定参照gb 5009.168-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》；维生素b2测定参照gb 5009.85-2016《食品安全国家标准 食品中维生素b2的测定》；维生素c测定参照gb 5009.86-2016 《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》；维生素b3、总烟酸、烟酰胺参照gb 5009.89-2016《食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定》；磷元素的测定参照gb 5009.87-2016《食品安全国家标准 食品中磷的测定》；锌的测定参照gb 5009.14-2017《食品安全国家标准 食品中锌的测定》；铁的测定参照gb 5009.90-2016 《食品安全国家标准 食品中铁的测定》；锰的测定参照gb 5009.242-2017《食品安全国家标准 食品中锰的测定》；镁的测定参照gb 5009.241-2017《食品安全国家标准 食品中镁的测定》；钙的测定参照gb 5009.92-2016《食品安全国家标准 食品中钙的测定》；铜的测定参照gb 5009.13-2017《食品安全国家标准 食品中铜的测定》；钾的测定参照gb 5009.91-2017《食品安全国家标准 食品中钾、钠的测定》；硒的测定参照gb 5009.93-2017《食品安全国家标准 食品中硒元素的测定》；镧的测定参照gb 5009.94-2012《食品安全国家标准 植物性食品中稀土元素的测定》。
46.表6 两株姬松茸菌株的营养物质统计
结果：从表6中可以看出，姬松茸zjjsr001菌株的各个营养物质及元素的含量均高于亲本fa菌株，说明姬松茸zjjsr001菌株的子实体的营养价值更高。