一种免疫细胞冻存液的制作方法

1.本发明涉及免疫细胞疗法领域，特别是涉及一种可回输型免疫细胞冻存液及其制备和使用方法。


背景技术：

2.免疫细胞疗法是一种继手术、化疗、放疗和靶向疗法后出现的新型疗法，是公认的二十一世纪最有希望在肿瘤治疗中能够完全消除肿瘤细胞的治疗手段。特别是，car-t细胞（chimeric antigen receptor-t cell，嵌合抗原受体-t细胞）疗法是免疫细胞疗法的主要代表，其利用基因工程技术手段，对患者自身的t细胞进行特异性改造，在体外大量扩增培养后回输至患者体内，从而实现特异性杀伤的作用。
3.免疫细胞在体外培养及运输过程中，随着培养时间的增加和环境条件的变化，细胞的亚型、分化程度、活化状态和功能状态等各种生物特性都在不断地变化，这与其功能作用的发挥密切相关。因此，对于免疫细胞制品的保存和远程运输，维持免疫细胞生物学活性不变是关键的。免疫细胞的有效冻存能够为其作为药物进行产业化应用提供必要的基础技术保障。
4.细胞冻存技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用。细胞冻存液是直接影响冻存后细胞活率、生物学活性等重要质量的关键因素。现有的细胞冻存液主要针对干细胞和肿瘤细胞，多以动物血清、高浓度二甲基亚砜（dmso）、患者自体血浆、非临床应用级试剂配制而成。这些细胞冻存液并不适用于免疫细胞且不能直接应用于人体输注。例如，cryostor
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cs10（stemcell technologies，07930）是在usp级cgmp条件下生产的配方明确、无血清、无动物成份、含有10% dmso的冻存保护剂，其设计用于在低温（-80
°
c至-196
°
c）条件下保护脐血及脐带组织、外周血、间充质干细胞、多能干细胞等其它敏感类型的细胞或组织样本。
5.目前没有令人满意的适合于免疫细胞的细胞冻存液。现有的细胞冻存液用于免疫细胞存在以下问题：(1)冻存过程中细胞易受到损伤，复苏后细胞得率低、活率低、活性低、成活率低、易老化、表面抗原丢失等；(2)冻存液中多含有血清，存在引入病原污染和过敏原的风险；(3)冻存液中dmso含量较高，其毒性作用增加临床使用风险，或导致后续应用需增加离心洗涤等程序，操作繁琐、低效且增加仪器设备成本；(4)冻存液配方过于复杂，应用不便且成本过高等。例如，cn107148967b公开了一种抗原特异性t淋巴细胞冻存液，该冻存液即存在配方复杂、配制不便的问题。


技术实现要素：

6.为解决上述问题，本发明涉及一种可回输型免疫细胞冻存液及其制备和使用方法。
7.与现有的细胞冻存液相比，本发明的免疫细胞冻存液的有益效果至少在于：1、复苏后免疫细胞得率（即回收率）高、活率（即活细胞比例）高及成活率（即细胞活力）高；2、复
苏后免疫细胞保持其免疫生物学特性（抗原表达、免疫表型等），与冻存前相比无显著差异；3、配方安全，均为临床药用级，具备临床应用安全性；4、不添加动物来源制品，避免相关风险（例如引入病原体和过敏原）；5、不使用患者自体血浆，原料数量和来源不受限制，适合产业化；6、dmso含量相对较低，复苏后无需清洗步骤即可直接静脉回输；7、原料容易获得，配制容易实施。
8.本发明的免疫细胞冻存液容易制备和使用，为免疫细胞存储、运输及使用的灵活性提供了技术支持。
9.本发明提供一种免疫细胞冻存液，其是由cryostor
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cs10、人血白蛋白注射液和氯化钠注射液制备而成的。
10.在一个实施方案中，所述氯化钠注射液的起始浓度为0.9% w/v。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液的起始浓度为20% w/v。在一个实施方案中，所述氯化钠注射液的起始浓度为0.9% w/v，且，所述人血白蛋白注射液的起始浓度为20% w/v。
11.在一个实施方案中，所述cryostor
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cs10的终浓度为约33.3%-66.7% v/v。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液的终浓度为约1.67%-3.33% w/v。在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10的终浓度为约33.3%-66.7% v/v，且，所述人血白蛋白注射液的终浓度为约1.67%-3.33% w/v。
12.在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10的终浓度为约50% v/v。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液的终浓度为约2.5% w/v。在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10的终浓度为约50% v/v，且，所述人血白蛋白注射液的终浓度为约2.5% w/v。
13.在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10:所述人血白蛋白注射液:所述氯化钠注射液的体积比为约2-8:约1:约3。在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10:所述人血白蛋白注射液:所述氯化钠注射液的体积比为约4:约1:约3。
14.本发明还提供制备和使用免疫细胞冻存液的方法。
15.在一个实施方案中，所述免疫细胞为淋巴细胞。在一个实施方案中，所述免疫细胞为t细胞。在一个实施方案中，所述免疫细胞是基因工程化的。在一个实施方案中，所述免疫细胞为car-t、tcr-t、car-m或car-nk细胞。
16.在一个实施方案中，所述的免疫细胞冻存液用于以约5
×
106至约1
×
108个细胞/ml的密度和/或以约1-100 ml的体积冻存免疫细胞。
附图说明
17.图1显示复苏后的活细胞数目。使用台盼蓝进行细胞染色和计数。冻存前每组活细胞数目为1
×
108。冻存复苏后1-8组的活细胞数目依次为9.30
×
107、9.06
×
107、9.04
×
107、8.06
×
107、6.96
×
107、6.08
×
107、5.04
×
107或6.54
×
107。
18.图2显示复苏后的活细胞比例，活细胞比例=活细胞数目/总细胞数目
×
100%。冻存前每组活细胞比例为97%。冻存复苏后1-8组的活细胞比例依次为96.3%、95.6%、97.1%、97.0%、92.1%、92.7%、90.3%或85.8%。
19.图3显示复苏后的活细胞得率，活细胞得率=复苏后的活细胞数目/冻存前的活细胞数目
×
100%。冻存复苏后1-8组的活细胞得率依次为93.0%、90.6%、90.4%、80.6%、69.6%、60.8%、50.4%或65.4%。
20.图4显示复苏后的car-t细胞比例，car-t细胞比例=car-t细胞数目/活细胞数目
×
100%。使用流式细胞术测定car-t细胞数目。冻存前car-t细胞比例为40.81%。冻存复苏后1-8组的car-t细胞比例依次为32.56%、34.38%、40.58%、36.91%、42.66%、39.19%、39.45%或34.18%。
21.图5显示复苏后的cd4/cd8 t细胞比率，cd4/cd8 t细胞比率=cd4阳性t细胞数目/cd8阳性t细胞数目。使用流式细胞术使用针对cd4和cd8的抗体测定cd4阳性或cd8阳性t细胞数目。冻存前cd4/cd8 t细胞比率为1.25。冻存复苏后1-8组的cd4/cd8 t细胞比率依次为1.37、1.37、1.33、1.40、1.20、1.35、1.20或1.13。
22.图6显示复苏后的t细胞亚型综合比例。使用流式细胞术测定各亚型t细胞数目。使用针对cd3的抗体鉴定t细胞，使用针对cd62l和cd45ra的抗体鉴定t细胞亚型，其中：cd62l
+
cd45ra-为中央记忆性t细胞（t
cm
），cd62l
+
cd45ra
+
为幼稚型t细胞（t
na
），cd62l-cd45ra-为效应性记忆t细胞（t
em
）。冻存前t
na
、t
em
和t
cm
三群细胞总比例为99.37%，冻存复苏后1-8组此三群细胞的总比例依次为92.72%、92.17%、96.22%、95.45%、92.66%、91.14%、97.02%或97.87%。
23.图7显示复苏后培养的活细胞数目。
24.图8显示复苏后培养的活细胞比例。
25.图9显示接受本发明冻存-复苏car-t细胞的小鼠的生存情况。溶媒对照组给药后第32天开始死亡，直到第69天全部死亡，中位生存期为49天；t细胞对照组给药后第13天开始死亡，直到第63天全部死亡，中位生存期为49天，与溶媒对照组相比无统计学差异（p＞0.05）；低剂量组给药后第31天开始死亡，直到第103天死亡8只，中位生存期为65天，与溶媒对照组相比有显著差异（p《0.05），与t细胞对照组相比有显著性差异（p＜0.05）；高剂量组给药后第8天开始死亡，直到第103天死亡6只，中位生存期为88天，高剂量组动物生存期与溶媒组、t细胞对照相比均有显著差异（p《0.05）。
26.图10显示接受本发明冻存-复苏car-t细胞的小鼠体内car-t细胞的增殖情况。给药第2-14天低剂量组外周血中car-t数目逐渐下降，14天后呈波动变化。给药第2-8天高剂量组外周血中car-t数目逐渐下降，第8-21天变化平稳，第21天后外周血中car-t数目明显上升。统计给药后第2-21天外周血car-t数据曲线下面积，高剂量组外周血中car-t数目显著高于低剂量组（p＜0.001）。
具体实施方式
27.本发明涉及一种可回输型免疫细胞冻存液，其由cryostor
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cs10、人血白蛋白注射液（例如，起始质量浓度为20%）和氯化钠注射液（例如，起始质量浓度为0.9%）组成。本发明优化了cryostor
®ꢀ
cs10、人血白蛋白注射液、氯化钠注射液的配比。例如，在无菌操作条件下，先配制由20% w/v人血白蛋白注射液和0.9% w/v氯化钠注射液按1:3的体积比混合而成的稀释液，再将cryostor
®ꢀ
cs10与稀释液按照1:1的体积比混合，即可得到可回输型免疫细胞冻存液。
28.一方面，本发明提供一种免疫细胞冻存液的稀释剂，其由人血白蛋白注射液和氯化钠注射液组成。本发明还提供一种制备免疫细胞冻存液的稀释剂的方法，其包括混合人血白蛋白注射液和氯化钠注射液。本发明还提供通过上述方法获得的免疫细胞冻存液的稀释剂。本发明还提供与通过上述方法获得的免疫细胞冻存液的稀释剂具有相同组成的免疫
细胞冻存液的稀释剂。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液的初始浓度为20% w/v。在一个实施方案中，所述氯化钠注射液的初始浓度为0.9% w/v。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液:所述氯化钠注射液的体积比为约1:约3。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液的终浓度为约5% w/v。
29.另一方面，本发明提供一种免疫细胞冻存液，其由cryostor
®ꢀ
cs10、人血白蛋白注射液和氯化钠注射液组成。本发明还提供一种制备免疫细胞冻存液的方法，其包括混合cryostor
®ꢀ
cs10、人血白蛋白注射液和氯化钠注射液。本发明还提供通过上述方法获得的免疫细胞冻存液。本发明还提供与通过上述方法获得的免疫细胞冻存液具有相同组成的免疫细胞冻存液。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液的初始浓度为20% w/v。在一个实施方案中，所述氯化钠注射液的初始浓度为0.9% w/v。在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10:所述人血白蛋白注射液:所述氯化钠注射液的体积比为约2-8:约1:约3。在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10:所述人血白蛋白注射液:所述氯化钠注射液的体积比为约2、3、4、5、6、7或8:约1:约3。在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10:所述人血白蛋白注射液:所述氯化钠注射液的体积比为约4:约1:约3。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液:所述氯化钠注射液的体积比为约1:约3，且，所述cryostor
®ꢀ
cs10:上述人血白蛋白注射液/氯化钠注射液混合液的体积比为约9:约1至约1:约9，例如约9:约1、约8:约1、约7:约1、约6:约1、约5:约1、约4:约1、约3:约1、约2:约1、约1:约1、约1:约2、约1:约3、约1:约4、约1:约5、约1:约6、约1:约7、约1:约8或约1:约9，特别是约1:约1。在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10的终浓度为约50% v/v。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液的终浓度为约2.5% w/v。
30.另一方面，本发明提供一种免疫细胞冻存液，其由cryostor
®ꢀ
cs10和人血白蛋白注射液组成。本发明还提供一种制备免疫细胞冻存液的方法，其包括混合cryostor
®ꢀ
cs10和人血白蛋白注射液。本发明还提供通过上述方法获得的免疫细胞冻存液。本发明还提供与通过上述方法获得的免疫细胞冻存液具有相同组成的免疫细胞冻存液。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液的初始浓度为20% w/v。在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10:所述人血白蛋白注射液的体积比为约5-9:约1。在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10:所述人血白蛋白注射液的体积比为约5、6、7、8或9:约1。在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10:所述人血白蛋白注射液的体积比为约7:约1。在一个实施方案中，所述cryostor
®ꢀ
cs10的终浓度为约87.5% v/v。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液的终浓度为约2.5% w/v。
31.另一方面，本发明提供一种免疫细胞冻存液，其由dmso、人血白蛋白注射液和氯化钠注射液组成。本发明还提供一种制备免疫细胞冻存液的方法，其包括混合dmso、人血白蛋白注射液和氯化钠注射液。本发明还提供通过上述方法获得的免疫细胞冻存液。本发明还提供与通过上述方法获得的免疫细胞冻存液具有相同组成的免疫细胞冻存液。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液的初始浓度为20% w/v。在一个实施方案中，所述氯化钠注射液的初始浓度为0.9% w/v。在一个实施方案中，所述dmso:所述人血白蛋白注射液:所述氯化钠注射液的体积比为约0.25-2:约2.25:约6.75。在一个实施方案中，所述dmso:所述人血白蛋白注射液:所述氯化钠注射液的体积比为约0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75或2:约2.25:约6.75。在一个实施方案中，所述dmso:所述人血白蛋白注射液:所述氯化钠注射
液的体积比为约1:约2.25:约6.75。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液:所述氯化钠注射液的体积比为约1:约3，且，所述dmso:上述人血白蛋白注射液/氯化钠注射液混合液的体积比为约1:约9至约1:约39，例如约1:约9、约1:约14、约1:约19、约1:约24、约1:约29、约1:约34或约1:约39。在一个实施方案中，所述dmso的终浓度为约10% v/v。在一个实施方案中，所述人血白蛋白注射液的终浓度为约4.5% w/v。
32.又一方面，本发明提供一种使用免疫细胞冻存液的方法，即冻存免疫细胞的方法，其包括以约5
×
106至约1
×
108个细胞/ml的密度和/或以约1-100 ml的体积在本发明的免疫细胞冻存液中重悬浮免疫细胞。
33.本发明提供一种免疫细胞冻存液，其具有下述一项或多项特征： (1) 使用dmso或cryostor
®ꢀ
cs10，特别是cryostor
®ꢀ
cs10制备； (2) 使用人血白蛋白注射液，特别是初始浓度20% w/v的人血白蛋白注射液制备； (3) 使用氯化钠注射液，特别是初始浓度0.9% w/v的氯化钠注射液制备； (4) 含有终浓度约2.5-10% v/v，例如约2.5% v/v、约3.3% v/v、约5% v/v、约6.7% v/v、约7.5% v/v或约10% v/v的dmso或终浓度约10-90% v/v，例如约10% v/v、约12.5% v/v、约20% v/v、约25% v/v、约30% v/v、约33.3% v/v、约40% v/v、约50% v/v、约60% v/v、约66.7% v/v、约70% v/v、约75% v/v、约80% v/v、约87.5% v/v或约90% v/v的cryostor
®ꢀ
cs10； (5) 含有终浓度约1-5% w/v，例如约1% w/v、约1.5% w/v、约1.67% w/v、约2% w/v、约2.5% w/v、约3% w/v、约3.33% w/v、约3.5% w/v、约4% w/v、约4.5% w/v或约5% w/v的人血白蛋白注射液；和/或 (6) 含有终浓度约0.1-0.9% w/v，例如约0.1% w/v、约0.2% w/v、约0.225% w/v、约0.3% w/v、约0.3375% w/v、约0.4% w/v、约0.45% w/v、约0.5% w/v、约0.6% w/v、约0.6075% w/v、约0.7% w/v、约0.8% w/v、约0.81% w/v或约0.9% w/v的氯化钠注射液。
34.在一个实施方案中，所述免疫细胞冻存液含有终浓度约50% v/v的cryostor
®ꢀ
cs10和终浓度约2.5% w/v的人血白蛋白注射液，且是使用初始浓度0.9% w/v的氯化钠注射液和任选地初始浓度20% w/v的人血白蛋白注射液制备的。在一个实施方案中，所述免疫细胞冻存液含有终浓度约66.7% v/v的cryostor
®ꢀ
cs10和终浓度约1.67% w/v的人血白蛋白注射液，且是使用初始浓度0.9% w/v的氯化钠注射液和任选地初始浓度20% w/v的人血白蛋白注射液制备的。在一个实施方案中，所述免疫细胞冻存液含有终浓度约87.5% v/v的cryostor
®ꢀ
cs10和终浓度约2.5% w/v的人血白蛋白注射液，任选地，是使用初始浓度20% w/v的人血白蛋白注射液制备的。在一个实施方案中，所述免疫细胞冻存液含有终浓度约10% v/v的dmso和终浓度约4.5% w/v的人血白蛋白注射液，且是使用初始浓度0.9% w/v的氯化钠注射液和任选地初始浓度20% w/v的人血白蛋白注射液制备的。
35.在一个实施方案中，所述免疫细胞冻存液用于以约5x106至约1x108个细胞/ml，例如约5x106个细胞/ml、约7.5x106个细胞/ml、约1x107个细胞/ml、约2.5x107个细胞/ml、约5x107个细胞/ml、约7.5x107个细胞/ml或约1x108个细胞/ml的密度和/或以约1-250 ml，例如约1 ml、约2 ml、约2.5 ml、约5 ml、约7.5 ml、约10 ml、约12.5 ml、约20 ml、约25 ml、约50 ml、约75 ml、约100 ml、约150 ml、约200 ml或约250 ml的体积冻存免疫细胞。例如，冻存容器可以是2 ml或5 ml细胞冻存管。将冻存管放入程序降温盒中，将程序降温盒放入超低温冰箱存放24小时，之后转移至液氮罐中长期保存。冻存容器也可以是50 ml或250 ml细胞冻存袋。在冻存袋中加入细胞悬浮液后应先排尽空气再封闭，使用程序降温仪降温，终点
温度为-80
°
c，然后转移至液氮罐中长期保存。
36.在一个实施方案中，所述免疫细胞是淋巴细胞。在一个实施方案中，所述免疫细胞是t细胞。在一个实施方案中，所述免疫细胞是基因工程化的。在一个实施方案中，所述免疫细胞是car-t细胞。本发明的免疫细胞冻存液也可以用于冻存其它类型的免疫细胞，诸如tcr-t、car-m、car-nk细胞。
37.在一个实施方案中，所述约20% w/v人血白蛋白注射液来自山西康宝，国药准字s20083019。在一个实施方案中，所述约0.9% w/v氯化钠注射液来自河北天成，国药准字h20033844。
38.在本文中，“约”表示所述数值或范围的
±
10%、
±
7.5%、
±
5%、
±
3%、
±
2.5%、
±
2%或
±
1%。
实施例
39.实施例1：car-t细胞制备。
40.使用cd3/cd28 dynabeads（thermo fisher，40203d）从健康志愿者的外周血单个核细胞（上海赛笠，slb-hp010b）中分离t细胞。将分离得到的t细胞（此时t细胞结合至cd3/cd28 dynabeads）在含500 iu/ml il-2（双鹭，国药准字s19991010）的x-vivo 15培养基（lonza，04-418q）中按1
×
106个细胞/ml的密度以50ml体积转移至t175培养瓶（falcon，353144）。放入37
°
c，5% co2恒温细胞培养箱（esco，ccl-170b-8）中静置培养48小时后，按moi=1的条件将例示性的携带car基因的慢病毒转导至t细胞中。病毒感染细胞24小时后，取全部细胞到50 ml离心管（corning，430828）中，置于离心机（thermo，st16r）中800 g离心5分钟，弃掉上清，用5 ml含500 iu/ml il-2的新鲜x-vivo 15培养基重悬浮细胞，转移至培养瓶并用上述培养基调节至1
×
106个细胞/ml的密度。继续培养9天后，收集所有细胞到50 ml离心管中，800 g离心5分钟，弃掉上清，用5 ml含500 iu/ml il-2的新鲜x-vivo 15培养基重悬浮细胞，转移至15 ml离心管（corning，430791），将离心管置于磁力架（thermo fisher，12301d）静置5分钟，待磁珠全部吸附于管壁后，轻轻地将细胞悬浮液转移至新容器，以去除培养体系中的dynabeads。取10
ꢀµ
l 4%台盼蓝（solarbio，c0040）与10
ꢀµ
l细胞悬浮液混合，并进行细胞计数。取部分细胞用针对cd3（bd，555339）、cd4（thermo fisher，48-0049-42）、cd8（biolegend，301038）、cd45ra（biolegend，304142）、cd62l（thermo fisher，25-0629-42）的抗体和自制的偶联fitc荧光分子的针对car的抗体标记，用流式细胞仪（acea biosciences，novocyte 2060r）检测细胞中的car-t细胞比例和t细胞分化水平。
41.实施例2：冻存液配制。
42.表1：不同冻存液配比
。
43.无菌条件下，先配制由20% w/v人血白蛋白注射液（山西康宝，国药准字s20083019）和0.9% w/v氯化钠注射液（河北天成，国药准字h20033844）按1:3的体积比混合而成的稀释液，再将cryostor
®ꢀ
cs10（stemcell，07930）与稀释液或人血白蛋白注射液或氯化钠注射液按照表1所示比例混合均匀，即可得到可回输型免疫细胞冻存液。
44.实施例3：细胞冻存。
45.取实施例1培养9天的处于对数生长期的去除dynabeads的car-t细胞，一部分用于检测基线活细胞比例、car-t细胞比例和t细胞亚群综合比例，一部分分别使用实施例2配制的冻存液进行冻存。对于冻存，活细胞密度为5
×
106个细胞/ml，体积为20 ml。将冻存袋（美天旎，200-074-400）置于程序降温仪（planer，kryo560-16）中进行程序降温，然后转移至液氮罐中长期保存，即得到冻存的car-t细胞。
46.实施例4：细胞复苏及检测。
47.细胞冻存2周后，从液氮罐中取出细胞冻存袋，立即置于37
°
c水浴锅中，快速（例如3-4次/秒）晃动直至细胞冻存液完全融化，得到复苏后的car-t细胞。细胞冻存液完全融化的时间不超过3分钟。收集复苏后的所有细胞，如实施例1所述，部分细胞用台盼蓝染色并进行细胞计数；部分细胞用针对cd4、cd8、cd45ra、cd62l的抗体和自制的偶联fitc荧光分子的针对car的抗体标记，用流式细胞仪检测各份细胞冻存液中的car-t细胞比例和t细胞分化水平。检测结果如图1-6。与冻存前相比，复苏后冻存液1的活细胞得率最高（93%），但其car-t细胞比例最低（32.56%）；冻存液5的car-t细胞比例最高（42.66%），但其活细胞得率较低（69.6%）；只有冻存液3的活细胞得率和car-t细胞比例均处于较高水平，而且冻存液3的活细胞比例保持最好，cd4/cd8 t细胞比率以及幼稚t细胞和记忆性t细胞的综合比例与冻存前相比也无显著改变。
48.实施例5：复苏后细胞继续培养。
49.表2：复苏后培养的活细胞数目和比例
。
50.取实施例4剩余的1
×
107个活细胞，如实施例1所述，培养4天，隔天更换培养基。然后，测定活细胞数目和比例。结果如图7-8所示。冻存液3在复苏后4天内活细胞数目无显著降低，而其它冻存液在复苏后活细胞数目随着培养时间延长均呈现不同程度的下降。而且，冻存液3在复苏后4天内活细胞比例也处于较高水平，无显著变化。具体数据见表2。
51.实施例6：car-t细胞在动物体内的活性。
52.按实施例1所述方法培养im21 car-t细胞（cn112321713b）。按实施例2的方法配制冻存液3。按实施例3的方法对im21 car-t细胞进行冻存，密度分别为5
×
106个car-t细胞/ml和2.5
×
107个car-t细胞/ml。除了不进行病毒感染外，对照t细胞采取与car-t细胞相同的方法进行培养和冻存，冻存密度为3.77
×
107个t细胞/ml。
53.ncg（南京集萃药康）雌性小鼠20只，6-8周龄，设置4个组：溶媒（冻存液）对照组，t细胞对照组（7.54
×
106个t细胞/只），低剂量组（1
×
106个car-t细胞/只）和高剂量组（5
×
106个car-t细胞/只）。所有动物尾静脉注射5
×
106个荧光素酶转染的h929细胞（atcc，crl-9068）进行建模。建模后第五天，按实施例4方法复苏细胞，并对每组小鼠尾静脉给予相应的溶媒（冻存液）、t细胞或im21 car-t细胞各200 μl。观察im21 car-t细胞对小鼠生存期的影响及其在动物体内的增殖情况。
54.发现im21 cat-t细胞可以明显延长动物的生存期（图9）并可在动物体内增殖（图10）。可见本发明的冻存液可以高效保护car-t细胞活性并能直接用于活体输注。
55.实施例7：car-t细胞冻存稳定性研究。
56.表3：不同时间冻存后活细胞数目、活细胞比例和car-t细胞比例
。
57.按实施例1所述方法培养im19 car-t细胞（cn105177031b）。按实施例2的方法配制冻存液3。按实施例3的方法对im19 car-t细胞进行冻存，密度为7.81
×
105个细胞/ml，体积为10 ml每袋，共7袋。分别在冻存后0.5个月、1个月、2个月、3个月、6个月、9个月和12个月复苏一袋细胞，检测活细胞数目、活细胞比例和car-t细胞比例。结果如表3所示。细胞在冻存12个月后依然保持较高的活细胞数目、活细胞比例和car-t细胞比例，可见本冻存液可以长时间对car-t细胞进行保护。
58.实施例8：car-t细胞冻存密度研究。
59.表4：细胞密度的变化。
60.表5：活细胞比例的变化
。
61.表6：car-t细胞比例的变化。
62.按实施例1所述方法培养im21 car-t细胞（cn112321713b）。按实施例2的方法配制冻存液3。按实施例3的方法对im21 car-t细胞进行冻存，总细胞密度分别为1
×
108、5
×
107、2.5
×
107、1
×
107或5
×
106个细胞/ml，体积均为10 ml每袋。冻存时间为14天。复苏后0小时、2小时和3小时检测细胞密度、活细胞比例和car-t细胞比例。结果如表4-6所示。以不同密度冻存并复苏后细胞密度、活细胞比例和car-t细胞比例与冻存前相比的变化率均小于10%，说明本冻存液可以在冻存过程中很好地保护细胞。复苏后3个小时，细胞密度、活细胞比例和car-t细胞比例的变化与刚复苏时相比均小于10%，说明本冻存液可以很好地保护复苏后的细胞至少3个小时。