浒苔多糖在促进芽孢杆菌生物膜形成中的应用

1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及浒苔多糖在促进芽孢杆菌生物膜形成中的应用。


背景技术：

2.在农业生产中，植物根际促生菌对作物健康和高产发挥重要影响，其应用是实现我国化学农药肥料减施、促进农业可持续发展的有效途径。目前，国内外学者已从水稻、小麦、玉米和棉花等重要作物根际分离获得大量具有防病促生效果的生防菌株，部分菌株已用于商业化生产。然而，生防菌进入土壤后面临着土著微生物的竞争及复杂的土壤环境条件，难以形成优势种群，发挥有效的生防功能，在实际应用中经常存在室内与田间防效差异大、田间防效不稳定等问题，导致其农业应用受到阻碍。高效的根际定殖是微生物发挥各种植物益生功能的重要前提，因此解决微生物菌株在植物根际定殖难的问题是破解生防菌农业应用受限的关键，而成膜能力是影响菌株在植物根际定殖能力的关键因素。
3.浒苔多糖是浒苔的主要活性成分，研究发现浒苔多糖具有抗肿瘤、抗凝血、降血糖血脂、提高免疫力、抗氧活性等功效。目前浒苔多糖在饲料、食品等领域的应用已经产业化，但尚未有利用浒苔多糖促进细菌生物膜形成的报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供浒苔多糖在促进芽孢杆菌生物膜形成中的应用，利用浒苔多糖有效的促进芽孢杆菌形成生物膜，进而促进菌株在植物根际的定植，同时本发明的浒苔多糖和芽孢杆菌联合施用还能够有效促进植物的生长。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了浒苔多糖在促进芽孢杆菌生物膜形成中的应用。
6.可选的，所述芽孢杆菌包括：枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的一种或几种。
7.可选的，所述浒苔多糖的提取步骤包括：
8.(1)取新鲜浒苔，冲洗后烘干，研磨成粉，过筛；
9.(2)将步骤(1)的浒苔粉加入水，微波带压提取，提取液离心；
10.(3)将步骤(2)中的离心液使用sevage试剂脱蛋白；
11.(4)使用截留分子量为3500的透析袋将步骤(3)脱蛋白的多糖溶液进行透析得到浒苔多糖粉末。
12.优选的，所述浒苔多糖的提取步骤(2)中微波反应器带压提取温度为120-150℃，微波功率为400-550w，微波反应器带压为0.2-0.7mpa，提取时间为15-30min。
13.可选的，所述浒苔多糖分子量为20-200kd。
14.本发明的另一目的是提供了一种芽孢杆菌菌剂，所述菌剂中包括浒苔多糖和芽孢杆菌。
15.可选的，所述浒苔多糖的使用浓度为0.5-15g/l。
16.可选的，所述菌剂的剂型可为水剂、可湿性粉剂、水分散颗粒或水悬浮剂。
17.可选的，所述菌剂中还包括分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
18.本发明的另一目的是提供上述芽孢杆菌菌剂在促进植物生长中的应用。
19.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
20.本发明的浒苔多糖既可以为芽孢杆菌的生长提供碳源，又能够有效促进芽孢杆菌生物膜的形成，并且在一定量的浒苔多糖添加范围内，对菌株生物膜形成的促进作用与浒苔多糖的浓度成正相关；浒苔多糖提取自新鲜浒苔，目前对浒苔多糖的利用多集中在饲料、食品等领域，本发明将浒苔多糖添加到芽孢杆菌菌剂中，为高效开发和应用浒苔资源提供了新的思路。
21.本发明提供的芽孢杆菌菌剂包括浒苔多糖和芽孢杆菌，菌剂中的浒苔多糖能够显著促进芽孢杆菌生物膜的形成，进而能够促进芽孢杆菌菌株在作物根际的有效定殖，从而达到进一步改良生防菌剂产品的目的。本发明的芽孢杆菌菌剂中添加的芽孢杆菌是土壤和植物微生态优势微生物种群之一，能够通过营养竞争、促进植物生长、诱导植物抗性、分泌抗菌物质的方式发挥作用，浒苔多糖和芽孢杆菌联合施用，能够使得芽孢杆菌在植株根际快速有效定植，形成优势菌种，进而可以显著促进植物的生长。
22.生物保藏说明
23.本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌em-1(拉丁名bacillus velezensis em-1)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmcc no.21131，保藏日期：2021年5月6日。
附图说明
24.图1：不同来源糖促进解淀粉芽孢杆菌cas02形成生物膜的能力，其中，man为甘露糖，rha为鼠李糖，gal为半乳糖，glu为葡萄糖，xyl为木糖，上述糖添加浓度均为5g/l，ep为浒苔多糖，添加浓度分别为0.5g/l，2.5g/l，5g/l，10g/l；
25.图2：浒苔多糖促进枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌均形成生物膜的能力，其中，t为枯草芽孢杆菌tpb55，e为贝莱斯芽孢杆菌em-1，ep为浒苔多糖，添加浓度分别为0.5g/l，5g/l；
26.图3：浒苔多糖促进解淀粉芽孢杆菌cas02在植物根际的有效定植，其中ck为施加无菌水，cas02为仅施加解淀粉芽孢杆菌cas02菌液，ep+cas02为施加含有浒苔多糖的解淀粉芽孢杆菌cas02菌液；
27.图4：浒苔多糖与解淀粉芽孢杆菌联合施用对植物生长的促进作用，图a为不同处理的烟草苗，图b为不同处理烟草苗生长的农艺性状，其中h2o为浇灌无菌水，ep为浇灌浒苔多糖溶液，c为浇灌解淀粉芽孢杆菌cas02菌液，ep+c为浒苔多糖与解淀粉芽孢杆菌联合施用。
具体实施方式
28.本发明提供了浒苔多糖在促进芽孢杆菌生物膜形成中的应用。本发明的浒苔多糖
能够为芽孢杆菌的生长提供碳源，并可以显著促进芽孢杆菌生物膜的形成，进而显著促进芽孢杆菌在植物根际的有效定植；本发明中的芽孢杆菌为根际促生菌，能够通过营养竞争、促进植物生长、诱导植物抗性、分泌抗菌物质的方式发挥作用，具有解磷、解钾、固氮的生物活性。
29.本发明芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的一种或几种。芽孢杆菌优选为解淀粉芽孢杆菌，进一步优选为解淀粉芽孢杆菌cas02，该菌株为中国专利cn108624543a中公开的菌株，并已于2018年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏编号为cgmcc no.15514。本发明中枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌tpb55，该菌株为文献biocontrol potential of antagonist bacillus subtilis tpb55 against tobacco black shank(han,t.et.al.biocontrol,2016,61(2),195-205.)中公开的菌株，并于2008年12月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏编号为cgmcc no.2853。本发明中的贝莱斯芽孢杆菌优选为贝莱斯芽孢杆菌em-1，该菌株于2021年5月6日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏编号为cgmccno.21131。本发明中添加的芽孢杆菌抗逆性强，且能够促进植物生长，抑制病原菌对植物的侵害。
30.本发明中浒苔多糖提取自新鲜浒苔，能够有效促进芽孢杆菌生物膜的形成，并且在浒苔多糖添加范围内，对芽孢杆菌生物膜形成的促进作用与浒苔多糖的浓度成正相关；并且浒苔多糖能够显著促进芽孢杆菌菌株在作物根际的有效定殖。
31.本发明提供了一种浒苔多糖提取方法，作为一种可实施的方式，本发明浒苔多糖的制备方法包括：取新鲜浒苔，冲洗后烘干，研磨成粉，过筛；取筛下浒苔粉加入水，微波带压提取，提取液离心；离心液使用sevage试剂；脱蛋白的多糖溶液使用截留分子量为3500的透析袋进行透析，得到浒苔多糖。
32.本发明将新鲜浒苔烘干研磨成粉后过40-70目筛，优选为过50-60目筛；
33.本发明将筛下浒苔粉按料液比1:15-40g/ml加入水，优选为料液比为1:20-30g/ml；其中，本发明对所加入的水没有特殊限定，采用本领域中常规的试验用水即可，作为一种可实施的方式，本发明添加的为蒸馏水；
34.本发明所述微波带压提取温度为120-150℃，优选为130-140℃；所述微波带压提取的微波功率为400-550w，优选为450-500w；所述微波带压提取的压力为0.2-0.7mpa，优选为0.4-0.6mpa；
35.本发明微波带压提取液冷却至60℃以下后，将提取液离心；
36.本发明采用sevage试剂脱蛋白时，离心液与sevage试剂比例为4-6:1，优选为4-5:1；离心液中加入sevage试剂后，充分振荡摇匀3-4h，静置15-25min，至蛋白呈不溶状态介于中间层，离心取上清液，重复操作3次；
37.本发明使用截留分子量为3500的透析袋将脱蛋白的多糖溶液进行透析40-50h，优选为45-48h；
38.本发明透析获得的浒苔多糖进行干燥，本发明对浒苔多糖的干燥方式没有特殊限定，采用本领域常规的干燥方式即可，作为一种可实施的方式，本发明采取真空冷冻干燥方
式，干燥时间为40-50h，优选为45-48h；
39.需要说明的是，本发明中提供的浒苔多糖的制备方法中所述的离心均为离心2次，离心参数为：5000-10000rpm，5-10min，优选为7000-8000rpm，7-8min；
40.本发明采取微波带压辅助提取浒苔多糖，提高了浒苔多糖的提取速率，并能够使浒苔多糖分子片段降低，提高浒苔多糖生物可利用性。
41.本发明中添加的浒苔多糖的分子量优选为20-200kd，本发明研究发现，分子量为20-200kd的浒苔多糖易形成产生活性的聚合结构，从而提高浒苔多糖的生物活性，有利于生物体的吸收利用，并降低浒苔多糖在应用中可能产生的抗原性和毒副作用。
42.本发明还提供了一种芽孢杆菌菌剂，菌剂中包括浒苔多糖和芽孢杆菌。
43.本发明的芽孢杆菌培养方法没有特殊限定，作为一种可实施的方式，本发明芽孢杆菌的培养包括：将菌株置于lb液体培养基中培养，培养条件为28℃下有氧培养12h。
44.其中，所述lb培养基为本领域常规培养基，其组分(g/l)为：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化钠10.0，ph7.0
±
0.2；同时，作为一种可实施的方式，本发明将接种菌株后的液体培养基置于摇床，120-160rpm振荡培养，优选为130-150rpm振荡培养。
45.在本发明中，将培养获得的芽孢杆菌菌液离心获得菌体，所述离心参数为6000rpm，5min，将菌体使用无菌水重悬至od
600
为0.1-1.0，优选为调节od
600
为0.2-0.5；将浒苔多糖添加入上述芽孢杆菌菌液中，优选菌液中的浒苔多糖使用浓度为0.5-15g/l，进一步优选为2.5-10g/l。
46.本发明芽孢杆菌菌剂的剂型可为水剂、可湿性粉剂、水分散颗粒或水悬浮剂。
47.本发明芽孢杆菌菌剂中还包括添加剂，所述添加剂包括分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
48.其中，所述分散剂为阴离子性分散剂和/或非离子性分散剂，可选择木质素磺酸钠、萘磺酸钠甲醛缩合物、亚甲基双萘磺酸钠、甲醛缩合物硫酸盐、聚羧酸盐、烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯和脂肪酸聚氧乙烯酯中的一种或多种；
49.所述湿润剂可选自十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、皂角粉、无患子粉、茶枯粉和拉开粉bx中一种或多种；
50.所述崩解剂可选自膨润土、硫酸铵、氯化铝、尿素、氯化镁和葡萄糖中的一种或多种；
51.所述粘结剂可选自，淀粉、硅藻土、环糊精、松香、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素和羧甲基纤维素盐中的一种或多种；
52.所述消泡剂可选自c8-c20脂肪醇类化合物、c10-c20饱和脂肪酸类化合物、环氧大豆油、乙醇、硅酮类化合物和有机硅油中的一种或多种；
53.所述抗冻剂可选自山梨醇、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、尿素和氯化钠中的一种或多种；
54.所述增稠剂可选自明胶、黄原胶、聚乙二醇和聚乙烯醇中的一种或多种；
55.所述填料可选自轻质碳酸钙、硅藻土、膨润土、凹凸棒土和白炭黑中的一种或多种；
56.所述溶剂可选自去离子水或油酸甲酯。
57.如无特殊说明，本发明根据所需制备的芽孢杆菌菌剂的剂型，可常规选择上述添
加剂，制成所需剂型。
58.如无特殊说明，本发明涉及的试剂、耗材等均可从商业途径获得，如未注明实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件进行。
59.本发明还提供了芽孢杆菌菌剂在促进植物生长中的应用。本发明提供的芽孢杆菌菌剂中浒苔多糖和芽孢杆菌联合施用，浒苔多糖能够为芽孢杆菌提供营养，使得菌剂施用后芽孢杆菌在营养充分的情况下保持生物活性，存活能力高，并且浒苔多糖能够显著促进芽孢杆菌生物膜的形成，使其迅速适应土壤环境，进而能够在植物根际快速有效定植，发挥功效，实现显著促进植物生长的效果。
60.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
61.实施例1
62.浒苔多糖促进解淀粉芽孢杆菌形成生物膜的能力
63.1、制备浒苔多糖：
64.(1)取新鲜浒苔，冲洗后烘干，研磨成粉，过60目筛；
65.(1)取5g筛下浒苔粉加入100ml的蒸馏水，在130℃，微波功率450w，微波反应器0.5mpa带压提取20min，冷却至60℃后，提取液两次离心(8000rpm，8min)；
66.(3)向步骤(2)离心上清液中加入sevage试剂，离心液与sevage试剂的比例为4:1，充分振荡摇匀3h，静置20min，蛋白呈不溶状态介于中间层，离心(4000rpm，10min)取上清液，重复操作3次；
67.(4)使用截留分子量为3500的透析袋将步骤(3)脱蛋白的多糖溶液进行透析48h，真空冷冻干燥48h，研磨获得分子量20-200kd的浒苔多糖。
68.2、制备含有不同种类糖的msnc寡营养培养液，msnc培养液组分为：5mm potassium phosphate buffer ph7，0.1m mops ph7，2mm mgcl2，0.05mm mncl2，1μm zncl2，2μm thiamine，700μm cacl2，0.2％nh4cl，0.5％cellobiose，添加糖种类及浓度见表1，其中添加的浒苔多糖为步骤1中的浒苔多糖。
69.表1msnc培养液中添加的不同来源糖及其添加浓度
[0070][0071]
3、将解淀粉芽孢杆菌cas02置于lb液体培养基中培养，培养条件为28℃，150rpm振荡培养12h，将培养的新鲜菌悬液使用无菌水调至od
600
＝0.3，吸取上述菌液13.5μl接种至步骤2中的msnc培养液。
[0072]
在静置状态下，30℃孵育24-72h，观察生物膜形成情况。
[0073]
由图1结果可知，当msnc培养液中未接种菌株，msnc培养液中未添加糖直接接种菌株，或在msnc培养液中分别添加5g/l的甘露糖，鼠李糖，半乳糖，葡萄糖，木糖后再接种菌株时，经72小时培养后，培养液表面均未出现生物膜；而当msnc培养液中分别添加浓度为0.5g/l、2.5g/l、5g/l和10g/l的浒苔多糖时，接种菌株后，经培养，培养液表面形成明显的生物膜。并且，当培养液中浒苔多糖的浓度为5g/l和10g/l时，接种菌株后经24小时培养即
可在培养液表面观察到明显的生物膜，说明浒苔多糖可以显著促进菌株生物膜的形成，且与多糖的浓度成正相关。
[0074]
实施例2
[0075]
浒苔多糖促进枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌形成生物膜的能力
[0076]
1、制备含有不同浓度浒苔多糖的msnc寡营养培养液，msnc培养液组分为：5mm potassium phosphate buffer ph7，0.1m mops ph7，2mm mgcl2，0.05mm mncl2，1μm zncl2，2μm thiamine，700μm cacl2，0.2％nh4cl，0.5％cellobiose，浒苔多糖添加浓度分别为0.5g/l和5.0g/l，其中添加的浒苔多糖为实施例1中制备的浒苔多糖。
[0077]
2、将枯草芽孢杆菌tpb55、贝莱斯芽孢杆菌em-1分别置于lb液体培养基中培养，培养条件为28℃，150rpm振荡培养12h，将培养的新鲜菌悬液使用无菌水调至od
600
＝0.3，吸取上述菌液13.5μl接种至步骤1中的msnc培养液。
[0078]
在静置状态下，30℃孵育24-48h，观察生物膜形成情况。
[0079]
由图2结果可知，当msnc培养液中未接种菌株，以及msnc培养液中未添加糖直接接种菌株时，经48小时培养后，培养液表面均未出现生物膜；而当msnc培养液中分别添加浓度为0.5g/l和5g/l的浒苔多糖时，接种菌株后，经培养，培养液表面形成明显的生物膜。说明浒苔多糖可以显著促进枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌生物膜的形成。
[0080]
实施例3
[0081]
本实施例提供了一种芽孢杆菌水剂，其组分为解淀粉芽孢杆菌和浒苔多糖
[0082]
所述芽孢杆菌水剂的制备方法为：
[0083]
1、将解淀粉芽孢杆菌置于lb液体培养基中培养，培养条件为28℃，150rpm振荡培养12h，将菌液离心(6000rpm，5min)获得菌体，用无菌水重悬菌体，调至od
600
＝0.3，备用；
[0084]
2、向步骤1获得的菌液中添加实施例1获得的浒苔多糖，并调节其在菌液中浓度为5g/l，即获得芽孢杆菌水剂。
[0085]
实施例4
[0086]
与实施例3的区别仅在于菌液中浒苔多糖浓度为10g/l。
[0087]
实施例5
[0088]
与实施例3的区别仅在于所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。
[0089]
实施例6
[0090]
与实施例3的区别仅在于所述芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌。
[0091]
实施例7
[0092]
浒苔多糖促进芽孢杆菌在植物根际的有效定植
[0093]
1、将解淀粉芽孢杆菌cas02置于lb液体培养基中培养，培养条件为28℃，150rpm振荡培养12h，将菌液离心(6000rpm，5min)获得菌体，用无菌水重悬菌体，调至od
600
＝0.3，备用；
[0094]
2、将烟草种子消毒后置于灭菌的营养基质中育苗，待烟苗长到4-5片叶时，将其移入含ms的营养液中；
[0095]
3、将移栽有烟苗的营养液分为三组：
[0096]
对照组ck：向营养液中加入2ml无菌水；
[0097]
实验组cas02：向营养液中施加2ml解淀粉芽孢杆菌(od
600
＝0.3)；
[0098]
实验组ep+cas02：向营养液中施加2ml实施例2中的芽孢杆菌水剂。
[0099]
4、烟苗在温室培养(光照条件：16h，28℃；黑暗条件：8h，20℃；相对湿度60％)，4天后将烟苗取出，用灭菌水冲洗根部，取1cm成熟区的根置于消毒的ep管中用于激光共聚焦观察菌株在根际的定殖情况。其中，激光共聚焦显微镜型号leica tcs sp8(mannheim,germany)，激发光波长488，接受光波长505-550。
[0100]
结果如图3所示，可知，实验组ep+cas02在烟草根际定植的芽孢杆菌数量最多，说明本发明提供的芽孢杆菌菌剂中的浒苔多糖可以显著促进芽孢杆菌在植物根际的定植。
[0101]
实施例8
[0102]
浒苔多糖与解淀粉芽孢杆菌联合施用对植物生长的促进作用
[0103]
1、将烟草种子消毒后置于灭菌的营养基质中育苗，待烟苗长到4-5片叶时，将其移入含有约180g自然土的花盆中(直径约10cm)，烟苗在温室培养(光照条件：16h，28℃；黑暗条件：8h，20℃；相对湿度60％)，每周浇灌灭菌水60ml/株；
[0104]
2、待烟苗长到6-7片叶时，对栽种烟苗的盆栽进行不同处理，每种处理5个重复：分别在植株周围均匀浇灌20ml无菌水(h2o)、20ml浒苔多糖(ep)、20ml解淀粉芽孢杆菌菌液(c)、20ml实施例2中的芽孢杆菌菌液(ep+c)；其中，浒苔多糖为实施例1制备获得，浓度为5g/l；解淀粉芽孢杆菌菌液为使用lb培养基培养的新鲜菌液，将菌液离心(6000rpm，5min)获得菌体，用无菌水重悬菌体，调至od
600
＝0.3，培养方法同实施例2；
[0105]
每5天浇灌一次，连续三次；第三次浇灌结束7天后检测芽孢杆菌对烟苗的促生效果。实验结果见图4及表2。
[0106]
表2不同试验处理农艺性状
[0107][0108]
注：数据为5次重复的平均值，不同字母代表同一性状不同处理在p﹤0.05水平下差异显著。
[0109]
由表2可知，本发明提供的芽孢杆菌菌剂中浒苔多糖与芽孢杆菌联合施用，与仅施用浒苔多糖、仅施用解淀粉芽孢杆菌相比，烟草株高、有效叶数、最大叶面积、叶绿素含量都显著增加，促进了烟草苗的生长；与浇灌无菌水的对照组相比，浒苔多糖与芽孢杆菌联合施用使得烟草株高增加11.11％，有效叶数增加16.38％，最大叶面积增加30.85％，叶绿素含量增加19.46％，植株干重增加5.63％。可见，浒苔多糖与芽孢杆菌联合施用能够显著促进植物的生长。
[0110]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。