一种植物线虫快速封片支撑剂的制作方法

1.本发明涉及植物线虫标本制作技术领域，具体涉及一种植物线虫永久玻片快速封片支撑剂。


背景技术：

2.线虫(nematodes)属于线虫门(nematoda)，是一类低等的蠕虫形无脊椎动物，假体腔、不分节，体长多在1mm左右(部分长针属线虫可长达9～10mm)。线虫种类多，分布广，全球线虫保守估计种类超过50万种，目前人类已经描述的线虫约25000种，其中4000多种为植物病原线虫。线虫以线形(或蠕虫形)为主，但也有些线虫膨大为肾形、球形或梨形等。由于线虫虫体微小且无色透明，人类肉眼一般看不到它们，必须先制作成临时玻片或永久玻片，借助显微镜才能观察线虫。因此，线虫永久玻片制片技术在线虫形态学鉴定过程中十分关键。
3.目前，线虫永久玻片制片通常需要经过打孔器加热蘸取石蜡，制作蜡环，挑取线虫，挑取玻璃纤维、加热，然后用指甲油、树脂等涂抹到盖玻片边缘封固，步骤较为繁琐，且需要较高的技巧，难以推广。
4.申请人2013年申请的专利cn103416393a公开了一种植物线虫临时玻片的制作方法，记载以石蜡作为支撑物和封片剂。2016年申请的专利cn106614520a一种植物线虫永久玻片的制作方法也是以石蜡块进行封片。但石蜡为有多孔状晶体结构，室温下容易升华，永久玻片制备数年后，由于毛细管作用，甘油会逐渐析出，导致甘油滴变少，石蜡变薄，标本损坏。申请人发现只使用石蜡封片的玻片标本，5年后由于石蜡的蒸发气化，导致石蜡流失变薄，标本被压扁损坏。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供新的线虫永久玻片的快速封片支撑剂，可以同时起到封片和支撑的作用，制片方法便捷、可操作性强、效果好。
6.本发明采用的技术方案是：
7.一种植物线虫快速封片支撑剂，所述封片支撑剂包括以下组分：石蜡、蜂蜡、纤维丝，所述石蜡、蜂蜡的质量比为1.2～2：1，石蜡、蜂蜡的总质量与纤维丝的质量比为80～120:1。
8.进一步，所述封片支撑剂优选由石蜡、蜂蜡、纤维丝组成。
9.进一步，石蜡、蜂蜡的质量比优选为1.3～1.5：1，更优选为1.5：1。
10.石蜡、蜂蜡的总质量与纤维丝的质量比优选为90～100:1，更优选为100：1。
11.所述纤维丝为有机纤维丝或玻璃纤维丝，所述有机纤维丝可以为聚丙烯纤维丝。
12.优选所述纤维丝为玻璃纤维丝。
13.所述纤维丝的长度为2-3mm，直径20-30微米。
14.所述植物线虫快速封片支撑剂优选按以下方法制得：
15.按照石蜡、蜂蜡的质量比为1.2～2：1(优选1.3～1.5：1)，加热至70～75℃融化，然
后加入纤维丝，石蜡、蜂蜡的总质量与纤维丝的质量比为80～120:1(优选100：1)，搅拌均匀后冷却至室温，制得所述植物线虫快速封片支撑剂。
16.本发明还提供利用所述植物线虫快速封片支撑剂来制作植物线虫永久玻片的方法，所述方法为：在载玻片上滴加甘油，将完全脱水浸泡于甘油中的线虫转移至载玻片的甘油滴中，在甘油滴对角线位置各放一块植物线虫快速封片支撑剂的切割小块(一般切割成正方体状小块，边长为2～3mm)，加盖玻片，加热至封片支撑剂块融化后冷却，制得所述植物线虫永久玻片。
17.进一步，移至甘油滴中央的线虫为已完全脱水的雌、雄线虫各1～3条，排列均匀。线虫脱水的方法可采用现有技术，用脱水液进行脱水。
18.所述加热至封片支撑剂块融化后冷却，一般是将玻片置于50～70℃(优选60～65℃)加热板上加热，所述加热的时间为20～40s(优选30s)。
19.本发明的有益效果在于：
20.本发明用石蜡和蜂蜡进行混配，能较好的解决石蜡容易升华的问题，制得的永久玻片可以保存更长时间。玻璃纤维可以起到支撑玻片的作用，但现有技术通常采用人工挑取玻璃纤维，人工操作难以量化和标准化，容易出现失误，本发明设计将玻璃纤维加入融化的溶液中搅匀，直接加入封片蜡中，在封片时能够一步同时完成封片和支撑，因此本发明提供的不仅仅是快速封片剂，其还可以起到支撑剂的作用。
21.本发明的快速封片支撑剂融化后，不但蜡本身形成支撑层，使线虫不至于被压扁，玻璃纤维丝进一步保证制片效果，防止线虫被压扁。石蜡和蜂蜡按特定比例混匀，有效避免了毛细管现象，制得的永久玻片可以常温放置5年以上。制备玻片时，两蜡块呈对角线放置，可有效避免蜡块融化时产生气泡。本发明方法不必再加封指甲油，也不必单独挑取玻璃纤维，大大方便了实验操作。
22.本发明简化了线虫永久玻片制作的复杂程序，降低了制作难度，大大提高了制片效率，为线虫永久玻片的制备提供了一种便捷、高效的新方法。
附图说明
23.图1采用石蜡封片的永久玻片放置5年以上的照片。
24.图2对比例1中a组照片。
25.图3对比例1中b组照片。
26.图4对比例1中c组照片。
27.图5对比例1中d组照片。
具体实施方式
28.下面以具体实施例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
29.实施例1
30.制备快速封片支撑剂：
31.称取30g石蜡和20g蜂蜡在70度高温下融化，之后加入0.5g玻璃纤维丝(长2-3mm，直径20-30微米)，用玻璃棒轻轻搅匀，然后停止加热，自然冷却，即制成快速封片支撑剂。然
后用刀切割成边长为2～3mm的正方体小块备用。
32.制备线虫永久玻片
33.a、在干净载玻片上用昆虫针或线虫挑针蘸取小滴甘油滴在载玻片上，用线虫挑针挑取已甘油处理好的松材线虫，其中雌虫和雄虫各3条，将线虫转移至甘油滴，在解剖镜下整理形态，使其沉底且均匀排列，尽量靠近甘油滴中央且不交叉；
34.b、在甘油滴的左上角和右下角对称放置两块快速封片支撑剂小块，加盖玻片，置于64℃的加热板上加热，加热30s待蜡块融化后自然冷却，制得线虫永久玻片。
35.对比例1
36.2012年制作的松材线虫的永久玻片，采用石蜡块进行封片，2017年显示石蜡流失，标本被压扁了。照片如图1所示。
37.申请人为解决这个技术问题，提出了新的快速封片支撑剂。
38.于2017年制作一批新的松材线虫的永久玻片，分为四组，a组使用石蜡块作为封片剂，b组使用石蜡、蜂蜡质量比5：1混合制得的封片剂，c组使用石蜡、蜂蜡质量比3：2混合制得的封片剂，d组使用实施例1方法制备的快速封片支撑剂，其余制片方法都一样，每种封片剂各制备3片永久玻片，室温放置至2022年，a组、b组、c组、d组的照片分别如图2～5所示，结果对比如下：
39.a组的三片均出现石蜡流失现象，标本被压扁。
40.b组中蜂蜡用量较少，石蜡仍出现少量流失，比a组流失量少，但长期放置仍然会被压扁。
41.c组因为没有混合玻璃纤维，石蜡虽然没有流失，但部分标本存在因封片剂不足，没有玻璃纤维支撑而出现的轻微压扁现象。
42.d组标本保存完好，三片都没有出现石蜡流失的问题，且支撑性较好。