一种见血青高效人工繁育的新方法

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种见血青高效人工繁育的新方法


背景技术：

2.地生型兰科(orchidaceae)植物是指植株根部生长在富含有机质土壤中的一类兰科植物，常有真菌共生现象。中国是世界上兰科植物资源最丰富的国家之一，有171属，1247种，且以地生兰为主，主要包括春兰cymbidium goeringii(rchb.f.)rchb.f.、墨兰cymbidium sinense(jackson ex andr.)willd.、寒兰cymbidium kanran makino、建兰cymbidium ensifolium(l.)sw.等，见血青liparis nervosa(thunb.)lindl.亦为地生兰的一种。见血青为羊耳蒜属(liparis)地生草本植物，其根状茎发达，假鳞茎细长且肉质，有数节，花亭发自茎顶端，总状花序松散具数朵至10余朵花，蒴果纺锤型，果期在每年10月；生于林下、草丛阴处或岩石覆盖土上，在中国主产于江西、湖南、福建、台湾、广东、广西、西南地区等地，在世界主要分布于热带与亚热带地区。见血青以全草入药，具有较高的药用价值，被苗医誉为“止血圣药”；在其传统产区，当地各族人民常用见血青治疗肺热吐血、风湿痹症、小儿惊风等。有学者对见血青进行过化学成分研究，并从中提取出了脉羊耳兰碱。随后又发现原黎芦因、吡咯里西啶等见血青内含生物碱在抗炎止血方面有很好的治疗效果。
3.兰科植物的种子细小且胚乳发育不全，萌发率极低，即使萌发成功，生长速度也非常缓慢，在自然状态下需与真菌共生才能正常萌发生长；面对气候变化、自然灾害等现象，兰科植物通常需要人工辅育技术才能在逆境中生存，否则野生种群极易灭绝。目前，见血青种质资源主要以野生为主，被中国《国家重点保护野生植物名录》收入，定为二级保护植物；见血青由于有性生殖效率低，无性繁殖周期长、遗传多样性水平低，其野生种群一经破坏便难以得到恢复，模式标本产区现已难觅其踪迹。见血青的生物学研究几近空白，仅在分类和化学成分上做了部分工作；而繁殖生物学，尤其是人工繁育方面的研究仅有利用种子非共生性萌发的报道，但成苗周期达270d，甚至更长。因此，急需寻求一种新的成本低、时间短、质量和成活率高的人工繁育方法，已成为见血青可持续利用以及大规模繁殖的必然选择。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决上述现有繁殖技术存在的缺陷，提供一种见血青高效人工繁育的新方法，该方法建立了见血青原球茎发生和增殖、芽发生、增殖以及植株再生等整个技术体系，为保护野生资源和发展人工栽培奠定了技术基础；同时，也可为其他地生兰科植物的体外快速繁殖研究提供参考
5.为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
6.一种见血青高效人工繁育的新方法，包括的步骤有：将消毒灭菌处理后的蒴果剖开，其内种子接种于萌发培养基中，待种皮破裂出现绿色原球茎后，进行原球茎增殖和分化、基茎丛生芽诱导，生根培养，炼苗移栽。
7.进一步地，一种见血青高效人工繁育的新方法，包括以下步骤：
8.(1)外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，人工授粉后取其成熟饱满蒴果；
9.(2)将1步骤的蒴果进行消毒处理；
10.(3)种子萌发、原球茎发生、增殖和分化：将经过步骤2消毒灭菌好的蒴果，在超净工作台上用手术刀纵向剖开，将其内种子均匀撒至下列a培养基中，所述a培养基，包括以下原料：
11.改良的ms基本培养液
12.活性炭(ac)
13.琼脂粉
14.控制光照度、温度、光照时间的条件下进行种子萌发、原球茎发生、增殖和分化；
15.(4)原球茎增殖并发育成幼苗：将步骤3培养的原球茎团转接至b培养基中，所述b培养基，包括以下原料：
16.1/3ms基本培养液
17.活性炭(ac)
18.香蕉泥
19.土豆泥
20.蔗糖
21.琼脂粉
22.控制光照度、温度、光照时间的条件下进行原球茎增殖并发育成苗；
23.(5)基茎丛生芽诱导：将步骤4中的丛生芽按单株分开，转接至c培养基中，所述c培养基，包括以下原材料：
24.1/3ms基本培养液
25.6-苄胺基嘌呤(6-ba)
26.萘乙酸(naa)
27.二氯苯氧乙酸(2,4-d)
28.活性炭(ac)
29.香蕉泥
30.土豆泥
31.蔗糖
32.琼脂粉
33.控制光照度、温度、光照时间的条件下进行基茎丛生芽诱导；
34.(6)复壮生根培养：取步骤5丛生芽中叶片大小、长势基本一致的幼苗，剪去部分根后接入d培养基中，所述d培养基，包括以下原料：
35.1/3ms基本培养液
36.萘乙酸(naa)
37.活性炭(ac)
38.香蕉泥
39.土豆泥
40.蔗糖
41.琼脂粉
42.控制光照度、温度、光照时间的条件下进行复壮生根培养；
43.(7)炼苗和移栽：取步骤6中的生根植株置于室温下炼苗3d后，从d培养基中取出幼苗，用清水洗净根部培养基，经多菌灵溶液中浸泡后放置于室内晾干水分，待其根部发白时，移栽至经高锰酸钾消毒后的腐质土中，保温保湿培养后，即得移栽苗。
44.进一步地，步骤2中所述蒴果进行消毒处理的方法为：将步骤1的蒴果先用自来水清洗表面灰尘和杂物，再用质量浓度为10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积比为75％的酒精消毒30s，再用质量百分比为0.1％的hgcl2灭菌30-40min，最后无菌水冲洗2-3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。
45.进一步地，步骤3中所述a培养基，包括以下原料：
46.改良的ms基本培养液
47.改良的ms配方：硝酸铵(nh4no3)、硝酸钾(kno3)、磷酸二氢钾(kh2po4)、七水硫酸镁(mgso
4`
7h2o)和二水氯化钙(cacl
2`
2h2o)用量减半；糖20g，其余成分不变。
48.活性炭(ac)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1000mg/l
49.蔗糖
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20000mg/l
50.琼脂粉
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4700mg/l。
51.进一步地，所述a培养基的ph值为5.4-5.6。
52.进一步地，将步骤3中原球茎与小植株混合物按照1.0
×
1.0cm一簇大小分割为一个材料单位，转接入步骤4中的b培养基中，所述b培养基，包括以下原料：
53.1/3ms基本培养液
[0054][0055]
进一步地，所述b培养基的ph值为5.4-5.6。
[0056]
进一步地，还包括以下步骤：将步骤4中丛生苗分割为单芽，转接入步骤5中c培养基中，所述c培养基，包括以下原料：
[0057]
1/3ms基本培养液
[0058]
[0059][0060]
进一步地，所述c培养基的ph值为5.4-5.6。
[0061]
进一步地，取步骤5丛生芽中叶片大小、长势基本一致的幼苗，剪去部分根后接入步骤6中的d培养基中，所述d培养基，包括以下原料：
[0062]
1/3ms基本培养液
[0063][0064]
进一步地，所述d培养基的ph值为5.4-5.6。
[0065]
进一步地，步骤7中所述多菌灵溶液的质量浓度为0.1-0.5％；所述基质消毒方法为，质量浓度为0.05-0.1％的高锰酸钾溶液喷撒至腐质土中，微湿后用塑料薄膜密封一周，备用。
[0066]
本发明具有以下有益效果：
[0067]
(1)本发明用组织培养技术在培养室内好可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统繁殖方式无法周年进行生产的难点。
[0068]
(2)本发明解决了传统种子繁殖效率低下，周期长等难题，通过本发明，可在短时间内获得数量极大的种苗，且成本低、周期短，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，可为大面积推广种植提供统一标准的优良种苗。
[0069]
(3)本发明把见血青的体外快繁过程进行了大幅调整，源于种皮破裂的原球茎发生、增殖和分化为幼苗一体化培养，此时，亦可进行生根培养，完成试管苗的再生，但随着培养代数的增加，原球茎增殖受阻，其数量急剧下降，且试管苗存在赢弱、驯化成活率低等问题；而对原球茎发育而来的幼苗继续培养则能产生大量的基茎丛生芽、高位芽和根蘗芽，由此避免了种子非共生性萌发的繁琐步骤和漫长周期，仅75d即可完成一个增殖周期，增殖系数达10.0以上；如此，可不断重复此过程，大大提高了人工繁育效率。
[0070]
(4)待原球茎发育完成后，整个培养过程只需2种培养基就解决了增殖和生根问题，利于安排生产计划。
[0071]
(5)本发明由于试管苗来源于原球茎，再生植株苗壮根粗，炼苗和移栽成活率高。
附图说明
[0072]
图1为见血青种子非共生性萌发的图，标尺＝1.5cm；
[0073]
其中图1-a为播种60d后种子开始转绿萌发图；图1-b为75d后大量种子种皮破裂产生原球茎图；图1-c为90d后部分原球茎发育为幼苗图；图1-d为105d后大量原球茎发育为幼苗图；图1-e为120d后原球茎开始增殖，早期发育的幼苗开始出现叶片图；图1-f为135d后原
球茎与小植株混合物覆盖整个培养基表面，并伴有明显的假根毛(rhizoids)图。
[0074]
图2为见血青原球茎增殖与分化的图，标尺＝1.5cm；
[0075]
图2-a为转接10d后原球茎幼芽混合物图；。图2-b为转接20d幼芽开始萌发成苗图；图2-c为转接30d原球茎大量发育为幼苗图；图2-d为50d后原球茎萌发为幼芽成“丛状”，此时原球茎数量开始减少图；图2-e为75d左右幼苗生长迅速，叶片伸展、颜色翠绿图；图2-f为空白对照图
[0076]
图3为基茎丛生芽和高位芽的增殖的图，标尺＝1.5cm；
[0077]
图3-a、b为转接20d后材料基部开始出现芽点图；图3-c、d为转接35d后芽点开始生长图；图3-e、f为转接50d后随着芽的生长，基部不断出现芽点图；图3-g、h为转接75d后的基茎丛生芽及高位芽图。
[0078]
图4为见血青根蘗芽再生的图，标尺＝2.0cm
[0079]
图4-a为培养30d后根上出现的幼芽图；图4-b为50后根上幼芽图；图4-c为75d后的根蘗苗图。
[0080]
图5为见血青生根培养的图，标尺＝1.5cm；
[0081]
图5-a、b、c、d为生根培养一个周期60d的生长情况图；图5-e、f、g、h为对应的瓶底观图。
[0082]
图6为见血青驯化移栽图，标尺＝2.0cm；
[0083]
图6-a为再生苗在基质中驯化图；图6-b为驯化30d后的根系图；图6-c、d为移栽苗。
具体实施方式
[0084]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0085]
实施例1
[0086]
一种见血青高效人工繁育的新方法，包括以下步骤：
[0087]
1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，人工授粉后取其成熟饱满蒴果。
[0088]
2、将步骤1的蒴果先用自来水清洗表面灰尘和杂物，再用质量浓度为10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积比为75％的酒精消毒30s，再用质量百分比为0.1％的hgcl2灭菌30min，最后无菌水冲洗2-3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。
[0089]
3、种子萌发、原球茎发生、增殖和分化：将经过步骤2消毒灭菌好的蒴果，在超净工作台上用手术刀纵向剖开，将其内种子均匀撒至下列a培养基中：
[0090]
改良的ms基本培养液
[0091]
改良的ms配方：硝酸铵(nh4no3)、硝酸钾(kno3)、磷酸二氢钾(kh2po4)、七水硫酸镁(mgso
4`
7h2o)和二水氯化钙(cacl
2`
2h2o)用量减半；糖20g，其余成分不变。
[0092][0093]
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22
±
1℃的条件下进行种子萌发，60d后，种子开始吸水膨胀，种皮破裂处开始产生绿色原球茎；75d后，早期原球茎开始发生；90d后，随着种子的萌发，原球茎也不断发生；105d后，部分原球茎发育成幼苗；同时原球茎增殖迅速，培养基表面可见部分假根毛；120d后假根毛和幼苗基本覆盖整个培养基表面；135d后的小植株长满整个培养基，此时增殖系数可达25.67。
[0094]
4、原球茎增殖并发育成幼苗：将步骤3中原球茎与小植株混合物按照1.0
×
1.0cm一簇大小分割为一个材料单位，转接入b培养基中：
[0095]
1/3ms基本培养液
[0096][0097]
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22
±
1℃的条件下培养。培养10d后绿色原球茎逐渐发育，出现大量的小芽点；20d后，原球茎大量萌发，部分绿色芽点发育为清晰可见的幼叶；30d后，新生芽生长迅速，具有3-4片小叶且茎与根的分化生长明显；50d后，幼苗已基本覆盖培养基表面；75d后，幼苗的小叶变为翠绿的大叶，整体植株初具见血青的植物学性状。此时，按丛为单位转接(一丛2-4株苗)，增殖系数可达15.50，芽分化率100％，但原球茎数量则急剧降低。而在1/3空白ms中，由于缺乏天然附加产物，原球茎萌发数量极少，未分化的原球茎逐渐死亡，小植株生长速度缓慢，叶片逐渐黄化慢慢死亡。
[0098]
5、将步骤4中丛生苗分割为单芽，转接入c培养基中：
[0099]
1/3ms基本培养液
[0100][0101]
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22
±
1℃的条件下培养20d后在茎尖基部与培养基接触的节上开始出现嫩黄色的芽点；35d后基部节上的小芽点分化为芽；50d后植株整体呈翠绿色，芽开始伸长且基部有新芽发生；75d后，基部不定芽迅速伸长，叶片伸展，形成茂密的芽丛，基茎丛生芽的发生率为100％，加上高位芽和根蘗芽，此时增殖系数可达10.84。
[0102]
6、复壮生根培养：将步骤5丛生芽中较大的芽单株分开，选取高为3cm、具2片叶子，长势基本一致的幼苗，根剪去2/3接入培养基d中：
[0103]
1/3ms基本培养液
[0104][0105]
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22
±
1℃的条件下培养，培养15d后植株明显长大，瓶底出现3-4条新根；培养30d后，植株叶片增多，植株明显长高，新根也在不断产生；培养45d后植株基部偶见新芽发生，根数量较30d明显增多；培养60d后瓶内根数量大约为15d的两倍，根毛覆盖在根系表面，十分有利于炼苗移栽。
[0106]
7、炼苗和移栽：取步骤6中具4片小叶，根长4cm，株高5cm生根植株置于室温下炼苗3d后，从d培养基中取出幼苗，用清水小心洗净根部培养基，经0.1％多菌灵溶液中浸泡3min后放置于室内晾干水分，待其根部发白时，移栽至经0.05％高锰酸钾消毒后的腐质土中，保温(20℃)保湿(70％)培养60d后，即得移栽苗，成活率100％。
[0107]
实施例2
[0108]
一种见血青高效人工繁育的新方法，包括以下步骤：
[0109]
1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，人工授粉后取其成熟饱满蒴果。
[0110]
2、将步骤1的蒴果先用自来水清洗表面灰尘和杂物，再用质量浓度为10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积比为75％的酒精消毒30s，再用质量百分比为0.1％的hgcl2灭菌40min，最后无菌水冲洗2-3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。
[0111]
3、种子萌发、原球茎发生、增殖和分化：将经过步骤2消毒灭菌好的蒴果，在超净工作台上用手术刀纵向剖开，将其内种子均匀撒至下列a培养基中：
[0112]
改良的ms基本培养液
[0113]
改良的ms配方：硝酸铵(nh4no3)、硝酸钾(kno3)、磷酸二氢钾(kh2po4)、七水硫酸镁(mgso
4`
7h2o)和二水氯化钙(cacl
2`
2h2o)用量减半；糖20g，其余成分不变。
[0114][0115]
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22
±
1℃的条件下进行种子萌发，60d后，种子开始吸水膨胀，种皮破裂处开始产生绿色原球茎；75d后，早期原球茎开始发生；90d后，随着种子的萌发，原球茎也不断发生；105d后，部分原球茎发育成幼苗；同时原球茎增殖迅速，培养基表面可见部分假根毛；120d后假根毛和幼苗基本覆盖整个培养基表面；135d后的小植株长满整个培养基，此时增殖系数可达26.15。
[0116]
4、原球茎增殖并发育成幼苗：将步骤3中原球茎与小植株混合物按照0.8
×
0.8左右cm一簇大小分割为一个材料单位，转接入b培养基中：
[0117]
1/3ms基本培养液
[0118][0119]
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22
±
1℃的条件下培养。培养10d后绿色原球茎逐渐发育，出现大量的小芽点；20d后，原球茎大量萌发，部分绿色芽点发育为清晰可见的幼叶；30d后，新生芽生长迅速，具有3-4片小叶且茎与根的分化生长明显；50d后，幼苗已基本覆盖培养基表面；75d后，幼苗的小叶变为翠绿的大叶，整体植株初具见血青的植物学性状。此时，按丛为单位转接(一丛2-4株苗)，增殖系数可达15.80，芽分化率100％，但原球茎数量则急剧降低。而在1/3空白ms中，由于缺乏天然附加产物，原球茎萌发数量极少，未分化的原球茎逐渐死亡，小植株生长速度缓慢，叶片逐渐黄化慢慢死
亡。
[0120]
5、将步骤4中丛生苗分割为单芽，转接入c培养基中：
[0121]
1/3ms基本培养液
[0122][0123]
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22
±
1℃的条件下培养20d后在茎尖基部与培养基接触的节上开始出现嫩黄色的芽点；35d后基部节上的小芽点分化为芽；50d后植株整体呈翠绿色，芽开始伸长且基部有新芽发生；75d后，基部不定芽迅速伸长，叶片伸展，形成茂密的芽丛，基茎丛生芽的发生率为100％，加上高位芽和根蘗芽，此时增殖系数可达10.25。
[0124]
6、复壮生根培养：将步骤5丛生芽中较大的芽单株分开，选取高为2.5cm、具3片叶子，长势基本一致的幼苗，根剪去2/3接入培养基d中：
[0125]
1/3ms基本培养液
[0126][0127][0128]
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22
±
1℃的条件下培养，培养15d后植株明显长大，瓶底出现3-4条新根；培养30d后，植株叶片增多，植株明显长高，新根也在不断产生；培养45d后植株基部偶见新芽发生，根数量较30d明显增多；培养60d后瓶内根数量大约为15d的两倍，根毛覆盖在根系表面，十分有利于炼苗移栽。
[0129]
7、炼苗和移栽：取步骤6中具4片小叶，根长3cm，株高6cm生根植株连瓶置于室温下炼苗3d后，打开瓶盖从d培养基中取出幼苗，用清水小心洗净根部培养基，经0.1％多菌灵溶液中浸泡5min后放置于室内晾干水分，待其根部发白时，移栽至经0.1％高锰酸钾消毒后的腐质土中，保温(22℃)保湿(75％)培养60d后，即得移栽苗，成活率100％。
[0130]
本发明的技术原理：
[0131]
本发明的核心在于见血青种皮破裂后产生原球茎以及后期当原球茎增殖受限后，利用幼苗带叶茎尖来不断获取再生植株，从而避免种子非共生性萌发的繁琐步骤和漫长的成苗周期；同时，证明了天然附加产物在见血青人工繁育中起着至关重要的作用。在随着培养代数的增加和幼苗分化后严重抑制原球茎增殖的情况下，采用单苗进行基茎丛生芽、茎高位芽和根蘗芽的诱导，摆脱了依赖种子非共生性萌发的繁殖方式。
[0132]
本发明提供的一种见血青高效人工繁育的新方法成本低、时间短、种苗质量和成活率高，且能将优良性状固定下来；通过该方法可用来扩大见血青种苗的繁殖量，从而进行高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。同时，本发明也为保护野生资源和发展人工栽培奠定了技术基础。
[0133]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。