一种骨碎补组培繁育的方法与流程

1.本发明属于骨碎补繁育技术领域，特别涉及一种骨碎补组培繁育的方法。


背景技术：

2.水龙骨科植物槲蕨[drynaria fortunei（kunze）j.sm.]，药材名为骨碎补。《本草纲目》记载：骨碎补，足少阴经药也，故能入骨，入牙，及久泄痢。《中华人民共和国药典》认定：其味苦，温，归肝、肾经，具有疗伤止痛，补肾强骨，外用消风祛斑的功效，主治跌扑闪挫、筋骨折伤、肾虚腰痛、筋骨痿软、耳鸣耳聋、牙齿松动等症。
[0003]
骨碎补是我国历代中医方剂的常用药材，是一百多个中成药的核心原料。现代研究表明：骨碎补具有良好的抗骨质疏松、促进骨折愈合、促软骨再生、促进牙齿生长、肾保护作用、抗炎、降血脂、防治中毒性耳聋等活性，还具有延缓衰老、美容养颜等作用，显现出巨大的开发应用前景。
[0004]
当前，骨碎补药材基本来源于野生资源，由于市场需求量大，加之骨碎补附生于树上、石壁上，生长缓慢，采挖困难，价格一路飙涨，民间疯狂采挖，导致野生资源日见稀少，其他类似植物的根茎也被充当骨碎补出售，造成了用药的安全隐患，亟需快速繁育出种苗，进行规模化种植。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于选育出株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到《中华人民共和国药典》要求的优良种质；然后进行种苗繁育，以获得遗传稳定性好、苗相一致、移栽成活率高的种苗，实现工厂化快速繁育，生产成本低，解决种苗繁育难题。
[0006]
为实现上述目的，本发明提供了一种骨碎补组培繁育的方法，包括如下步骤：（1）分别从广西、贵州、湖南、湖北、江西等地收集骨碎补野生种质资源，以农艺性状、有效成分含量等指标进行综合评定，选育出株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到《中华人民共和国药典》要求的优良种质；（2）外植体的选择及处理：选择优良种质的幼嫩根状茎作为外植体，将带有生长点的根茎切下，用水冲洗表面泥沙，去除表面绒毛，得到无绒毛的外植体；（3）灭菌处理：用0.1wt％升汞对步骤（2）所述的无绒毛的外植体进行灭菌处理，灭菌时间8～10min，得到灭菌的外植体；（4）诱导培养：将灭菌的外植体转接到诱导培养基中进行培养，培养过程中，每隔9～12天将外植体表面坏死的组织刮掉，并将外植体转接到新的诱导培养基中，直至外植体长出无菌芽；所述诱导培养基为包括1.0～1.5mg/ml ba、0.1mg/mlnaa、30g/l糖、4.0～5.5g/l琼脂的ms培养基；（5）继代培养：将步骤（4）中诱导获得的无菌芽转接到继代培养基中培养25～30天，诱导形成丛生芽；所述继代培养基为包括0.5～1.0mg/ml ba、0.5mg/mlnaa的ms培养基；（6）生根培养：将步骤（5）中诱导形成的丛生芽切分成多个单株，转接到生根培养
基中培养45～60天，即得骨碎补生根苗；所述生根培养基为包括0.2mg/mliba、0.5mg/mlnaa、30g/l糖、4.0～5.5g/l琼脂、0.2g/l活性炭的1/2ms培养基。
[0007]
进一步地，所述步骤（1）中选择株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到《中华人民共和国药典》优良种质的幼嫩根状茎作为外植体。
[0008]
进一步地，所述步骤（2）中去除外植体表面绒毛前，先在外植体分布有绒毛的位置喷洒绒毛软化去除剂，放置5～8min，再用水冲洗掉外植体表面的绒毛即可；所述绒毛软化去除剂由以下重量份的组分组成：碳酸氢钠6～8份、海藻糖12～15份、氯化钠1～3份、乙醇6～10份、丙醇5～7份、蒸馏水100～120份。
[0009]
进一步地，所述步骤（2）中所述绒毛软化脱除剂由以下重量份的组分组成：碳酸氢钠7～8份、海藻糖13～15份、氯化钠2～3份、乙醇7～10份、丙醇6～7份、蒸馏水110～120份。
[0010]
进一步地，所述步骤（3）中用0.1wt％升汞对所述的无绒毛的外植体进行灭菌处理，灭菌时间8～10min，得到灭菌的外植体。
[0011]
进一步地，所述步骤（4）中将灭菌的外植体转接到诱导培养基中进行培养，培养过程中，每隔9～12天将外植体表面坏死的组织刮掉，并将外植体转接到新的诱导培养基中，直至外植体长出无菌芽；所述诱导培养基为包括1.2～1.5mg/mlba、0.1mg/mlnaa、30g/l糖、4.5～5.5g/l琼脂的ms培养基。
[0012]
进一步地，所述步骤（5）中将步骤（4）中诱导获得的无菌芽转接到继代培养基中培养27～30天，诱导形成丛生芽；所述继代培养基为包括0.7～1.0mg/mlba、0.5mg/mlnaa的ms培养基。
[0013]
进一步地，所述步骤（6）中将丛生芽切分成多个单株，转接到生根培养基中培养48～60天，即得骨碎补生根苗；所述生根培养基为包括0.2mg/mliba、0.5mg/mlnaa、30g/l糖、4.7～5.5g/l琼脂、0.2g/l活性炭的1/2ms培养基。
[0014]
与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明方法分别从广西、贵州、湖南、湖北、江西等地收集骨碎补野生种质资源，以农艺性状、有效成分含量等指标进行综合评定，选育出株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到《中华人民共和国药典》要求的优良种质，采集优良种质的根状茎进行组培繁育，可获得遗传稳定性好、苗相一致、移栽成活率高的种苗，可实现工厂化快速繁育，生产成本低，解决种苗繁育难题。
[0015]
2.本发明的种苗繁育方法不受天气等自然因素的影响，一年四季都可培育种苗，具有很高的推广应用价值。
[0016]
本发明一种骨碎补组培繁育的方法，去除外植体表面绒毛前，先在外植体分布有绒毛的位置处喷洒绒毛软化去除剂，绒毛软化去除剂由多糖、混合醇、碳酸氢钠等组分组成，可温和作用于绒毛根部，起到软化绒毛、脱除绒毛的作用，外植体表面的绒毛去除得更干净，且能最大限度降低去除绒毛对生长点造成的伤害，提升外植体萌发率，且绒毛软化去除剂具备一定抑菌的效果，提高无菌芽得率。
附图说明
[0017]
图1是本发明实施例1中继代培养的图片；图2是本发明实施例1中丛生芽的图片；
图3是本发明实施例1中生根培养的图片。
[0018]
图4是本发明实施例1中工厂化繁育种苗图片。
具体实施方式
[0019]
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不能以任何方式限制本发明。
[0020]
本发明一种骨碎补组培繁育的方法，下述实施例所用外植体是从广西桂林、贵州毕节、湖南怀化、湖北宜昌、江西赣州收集得到的骨碎补野生种质资源选育的优良种质，其优良种质株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到了《中华人民共和国药典》要求。
[0021]
实施例1一种骨碎补组培繁育的方法，包括如下步骤：（1）外植体的选择及处理：从广西桂林的野生骨碎补中选择株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到《中华人民共和国药典》要求的优良种质的幼嫩根状茎作为外植体，将带有生长点的根茎切下，用水冲洗表面泥沙，去除外植体表面绒毛前，先在外植体分布有绒毛的位置处喷洒绒毛软化去除剂，放置5min，再用水冲洗掉外植体表面的绒毛，即可轻松去除绒毛，得到无绒毛的外植体；所述绒毛软化去除剂由以下重量份的组分组成：碳酸氢钠6份、海藻糖12份、氯化钠1份、乙醇6份、丙醇5份、蒸馏水100份；（2）灭菌处理：用0.1wt％升汞对所述的无绒毛的外植体进行灭菌处理，灭菌时间7min，得到灭菌的外植体；（3）诱导培养：将灭菌的外植体转接到诱导培养基中进行培养，培养过程中，每隔9天将外植体表面坏死的组织刮掉，并将外植体转接到新的诱导培养基中，直至外植体长出无菌芽；所述诱导培养基为包括1.0mg/mlba、0.1mg/mlnaa、30g/l糖、4.0g/l琼脂的ms培养基；（4）继代培养：将步骤（3）中诱导获得的无菌芽转接到继代培养基中培养25天，诱导形成丛生芽；所述继代培养基为包括0.5mg/mlba、0.5mg/mlnaa的ms培养基；（5）生根培养：将步骤（4）中诱导形成的丛生芽切分成多个单株，转接到生根培养基中培养45天，即得骨碎补生根苗；所述生根培养基为包括0.2mg/mliba、0.5mg/mlnaa、30g/l糖、4.0g/l琼脂、0.2g/l活性炭的1/2ms培养基。
[0022]
实施例2一种骨碎补组培繁育的方法，包括如下步骤：（1）外植体的选择及处理：从贵州毕节的野生骨碎补中选择株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到《中华人民共和国药典》要求的优良种质的幼嫩根状茎作为外植体，将带有生长点的根茎切下，用水冲洗表面泥沙，去除外植体表面绒毛前，先在外植体分布有绒毛的位置处喷洒绒毛软化去除剂，放置8min，再用水冲洗掉外植体表面的绒毛，即可轻松去除绒毛，得到无绒毛的外植体；所述绒毛软化去除剂由以下重量份的组分组成：碳酸氢钠8份、海藻糖15份、氯化钠3份、乙醇10份、丙醇7份、蒸馏水120份；（2）灭菌处理：用0.1wt％升汞对所述无绒毛的外植体进行灭菌处理，灭菌时间
10min，得到灭菌的外植体；（3）诱导培养：将灭菌的外植体转接到诱导培养基中进行培养，培养过程中，每隔12天将外植体表面坏死的组织刮掉，并将外植体转接到新的诱导培养基中，直至外植体长出无菌芽；诱导培养基为包括1.5mg/mlba、0.1mg/mlnaa、30g/l糖、5.5g/l琼脂的ms培养基；（4）继代培养：将步骤（3）中诱导获得的无菌芽转接到继代培养基中培养30天，诱导形成丛生芽；所述继代培养基为包括1.0mg/mlba、0.5mg/mlnaa的ms培养基；（5）生根培养：将步骤（4）中诱导形成的丛生芽切分成多个单株，转接到生根培养基中培养60天，即得骨碎补生根苗；所述生根培养基为包括0.2mg/mliba、0.5mg/mlnaa、30g/l糖、5.5g/l琼脂、0.2g/l活性炭的1/2ms培养基。
[0023]
实施例3一种骨碎补组培繁育的方法，包括如下步骤：（1）外植体的选择及处理：从湖南怀化的野生骨碎补中选择株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到《中华人民共和国药典》要求的优良种质的幼嫩根状茎作为外植体，将带有生长点的根茎切下，用水冲洗表面泥沙，去除外植体表面绒毛前，先在外植体分布有绒毛的位置处喷洒绒毛软化去除剂，放置6min，再用水冲洗掉外植体表面的绒毛，即可轻松去除绒毛，得到无绒毛的外植体；所述绒毛软化去除剂由以下重量份的组分组成：碳酸氢钠7份、海藻糖13份、氯化钠2份、乙醇7份、丙醇6份、蒸馏水110份；（2）灭菌处理：用0.1wt％升汞对所述的无绒毛的外植体进行灭菌处理，灭菌时间8min，得到灭菌的外植体；（3）诱导培养：将灭菌的外植体转接到诱导培养基中进行培养，培养过程中，每隔9天将外植体表面坏死的组织刮掉，并将外植体转接到新的诱导培养基中，直至外植体长出无菌芽；所述诱导培养基为包括1.2mg/mlba、0.1mg/mlnaa、30g/l糖、4.5g/l琼脂的ms培养基；（4）继代培养：将步骤（3）中诱导获得的无菌芽转接到继代培养基中培养27天，诱导形成丛生芽；所述继代培养基为包括0.7mg/mlba、0.5mg/mlnaa的ms培养基；（5）生根培养：将步骤（4）中诱导形成的丛生芽切分成多个单株，转接到生根培养基中培养48天，即得骨碎补生根苗；所述生根培养基为包括0.2mg/mliba、0.5mg/mlnaa、30g/l糖、4.7g/l琼脂、0.2g/l活性炭的1/2ms培养基。
[0024]
实施例4一种骨碎补组培繁育的方法，包括如下步骤：（1）外植体的选择及处理：从湖北宜昌的野生骨碎补中选择株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到《中华人民共和国药典》要求的优良种质的幼嫩根状茎作为外植体，将带有生长点的根茎切下，用水冲洗表面泥沙，去除外植体表面绒毛，得到无绒毛的外植体；（2）灭菌处理：用0.1wt％升汞对所述的无绒毛的外植体进行灭菌处理，灭菌时间8min，得到灭菌的外植体；（3）诱导培养：将灭菌的外植体转接到诱导培养基中进行培养，培养过程中，每隔9天将外植体表面坏死的组织刮掉，并将外植体转接到新的诱导培养基中，直至外植体长出
新芽；所述诱导培养基为包括1.2mg/mlba、0.1mg/mlnaa、30g/l糖、4.5g/l琼脂的ms培养基；（4）继代培养：将步骤（3）中诱导获得的无菌芽转接到继代培养基中培养27天，诱导形成丛生芽；所述继代培养基为包括0.7mg/mlba、0.5mg/mlnaa的ms培养基；（5）生根培养：将步骤（4）中诱导形成的丛生芽切分成多个单株，转接到生根培养基中培养48天，即得骨碎补生根苗；所述生根培养基为包括0.2mg/mliba、0.5mg/mlnaa、30g/l糖、4.7g/l琼脂、0.2g/l活性炭的1/2ms培养基。
[0025]
实施例5一种骨碎补组培繁育的方法，包括如下步骤：（1）外植体的选择及处理：从江西赣州的野生骨碎补中选择株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到《中华人民共和国药典》要求的优良种质的幼嫩根状茎作为外植体，将带有生长点的根茎切下，用水冲洗表面泥沙，去除外植体表面绒毛前，先在外植体分布有绒毛的位置处喷洒绒毛软化去除剂，放置6min，再用水冲洗掉外植体表面的绒毛，即可轻松去除绒毛，得到无绒毛的外植体；所述绒毛软化去除剂由以下重量份的组分组成：碳酸氢钠7份、海藻糖13份、氯化钠2份、乙醇7份、丙醇6份、蒸馏水110份；（2）灭菌处理：用0.1wt％升汞对所述的无绒毛的外植体进行灭菌处理，灭菌时间8min，得到灭菌的外植体；（3）诱导培养：将灭菌的外植体转接到诱导培养基中进行培养；所述诱导培养基为包括1.2mg/mlba、0.1mg/mlnaa、30g/l糖、4.5g/l琼脂的ms培养基；（4）继代培养：将步骤（3）中诱导获得的无菌芽转接到继代培养基中培养27天，诱导形成丛生芽；所述继代培养基为包括0.7mg/mlba、0.5mg/mlnaa的ms培养基；（5）生根培养：将步骤（4）中诱导形成的丛生芽切分成多个单株，转接到生根培养基中培养48天，即得骨碎补生根苗；所述生根培养基为包括0.2mg/mliba、0.5mg/mlnaa、30g/l糖、4.7g/l琼脂、0.2g/l活性炭的1/2ms培养基。
[0026]
对比例1一种骨碎补组培繁育的方法，包括如下步骤：（1）外植体的选择及处理：从广西桂林的野生骨碎补中选择株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到《中华人民共和国药典》要求的优良种质的幼嫩根状茎作为外植体，将带有生长点的根茎切下，用水冲洗表面泥沙，去除外植体表面绒毛前，先在外植体分布有绒毛的位置处喷洒绒毛软化去除剂，放置6min，再用水冲洗掉外植体表面的绒毛，即可轻松剥去绒毛，得到无绒毛的外植体；所述绒毛软化去除剂由以下重量份的组分组成：碳酸氢钠7份、海藻糖13份、氯化钠2份、乙醇7份、丙醇6份、蒸馏水110份；（2）灭菌处理：用0.1wt％升汞对所述的无绒毛的外植体进行灭菌处理，灭菌时间8min，得到灭菌的外植体；（3）诱导培养：将灭菌的外植体转接到诱导培养基中进行培养，培养过程中，每隔9天将外植体表面坏死的组织刮掉，并将外植体转接到新的诱导培养基中，直至外植体长出无菌芽；所述诱导培养基为包括1.2mg/mlba、0.1mg/mlnaa、30g/l糖、4.5g/l琼脂的ms培养基；
（4）继代培养：将步骤（3）中诱导获得的无菌芽转接到继代培养基中培养27天，诱导形成丛生芽；所述继代培养基为包括0.7mg/mlba、0.5mg/mlnaa的ms培养基；（5）生根培养：将步骤（4）中诱导形成的丛生芽切分成多个单株，转接到生根培养基中培养48天，即得骨碎补生根苗；所述生根培养基为包括0.2mg/mliba、0.5mg/mlnaa、30g/l糖、4.7g/l琼脂的1/2ms培养基。
[0027]
统计上述实施例1-5及对比例1中骨碎补组培繁育的各项数据，统计结果如下表1所示；表1
项目外植体数量萌芽数无菌芽数芽的诱导率（%）污染率（%）绒毛去除情况实施例15031346232干净无残留实施例25030326036干净无残留实施例35030306040干净无残留实施例45012152452干净，基本无残留实施例55018333634干净无残留对比例15031346232干净无残留
由上述实施例1-5及对比例1中骨碎补组培繁育各项数据的统计结果可知，本发明方法分别从广西、贵州、湖南、湖北、江西等地收集骨碎补野生种质资源，以农艺性状、有效成分含量等指标进行综合评定，选育出株型大、长势旺盛、有效成分含量等指标达到《中华人民共和国药典》要求的优良种质，采集优良种质的根状茎进行组培繁育，可获得遗传稳定性好、苗相一致、移栽成活率高的种苗，可实现工厂化快速繁育，生产成本低，解决种苗繁育难题。
[0028]
本发明的种苗繁育方法不受天气等自然因素的影响，一年四季都可培育种苗，具有很高的推广应用价值。
[0029]
本发明一种骨碎补组培繁育的方法，去除外植体表面绒毛前，先在外植体分布有绒毛的位置处喷洒绒毛软化去除剂，绒毛软化去除剂由多糖、混合醇、碳酸氢钠等组分组成，可温和作用于绒毛根部，起到软化绒毛、去除绒毛的作用，外植体表面的绒毛去除得更干净，且能最大限度降低去除绒毛对生长点造成的伤害，提升外植体萌发率，且绒毛软化去除剂具备一定抑菌的效果，提高无菌芽得率。
[0030]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。