一种促进巨型南瓜果实增大的方法

1.本发明涉及南瓜栽培技术领域，尤其涉及一种促进巨型南瓜果实增大的 方法。


背景技术：

2.巨型南瓜atlantic giant是葫芦科南瓜属中果实超大的一个特殊类型，单 果重可以到达数百千克，其果实外形美观，为高圆球形或椭圆形；果皮光滑、 颜色艳丽，多为红、黄和橙黄色；其果肉颜色为黄色或橙色，即可食用，又 极具观赏价值。世界上多个国家和地区每年都会举行种植“举行南瓜的比 赛”，近年来由于品种的定向选育，以及栽培技术条件的改善，巨型南瓜单 果重的世界纪录也在不断刷新。目前，1226.0kg的巨型大南瓜，创世界南 瓜最重纪录，载入吉尼斯世界纪录。
3.随着我国产业结构的调整，观光农业和特色农业的发展，各地也掀起了 种植巨型南瓜的热潮，已成为全国各地多个农业园区的吸引游客的重点项 目。此外巨型南瓜每年都是一些博览会的参观热点，深受广大游客的青睐。 巨型南瓜的培植成功，不仅展示了先进的现代农业育种技术和栽培技术，成 为农业科普教育的亮点，而且丰富了景区农业观光旅游内容，具有较高的商 业价值。对于巨型南瓜来说，果实大小是最重要的果实品质属性，制定切实 可行的策略来改善果实大小具有重大意义。巨型南瓜的栽培往往是通过增加 叶片的数量供应养分，利用不定根扩大养分吸收面积；或者在冷凉地区种植， 越过夏天延长种植期等方法增加果实的重量。目前尚未见利用生长调节剂调 节南瓜果实重量的相关报道。


技术实现要素：

4.本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种 促进巨型南瓜果实增大的方法，目的是通过对南瓜生长发育的不同时期喷 施生长调节剂进行调控，加快南瓜的快速膨大，提高其观赏价值和经济价 值。
5.基于上述目的，本发明提供了一种促进巨型南瓜果实增大的方法，包 括如下步骤：
6.步骤一、对巨型南瓜常规育苗，待幼苗长至三叶一心时定植，每棵植 株挖一个50cm深、1～1.5m直径的定植穴；
7.步骤二、南瓜定植后20d、开花当天以及花后10～30d分阶段喷施生长 调节剂，通过对南瓜生长过程中光合特性、糖代谢相关酶活性和基因表 达、可溶性糖的含量影响研究，以确定喷施生长调节剂的组合浓度，促进 南瓜果实增大。
8.作为一种可选的实施方式，所述生长调节剂为naa和ebr的组合调节 剂，naa的浓度为20～30mg
·
l-1
，ebr的浓度为0.5～1.5mg
·
l-1
。
9.优选的，所述南瓜定植后20d、开花当天、花后10d以及花后20d喷施 naa和ebr的组合调节剂。
10.更优选的，所述naa的浓度为20mg
·
l-1
，ebr的浓度为1.0mg
·
l-1
。此 浓度为最佳组合浓度，相对能够更好的为促进南瓜果实增大。
11.优选的，喷施的部位为果实和叶片正反面。
12.优选的，设置株行距5m
×
2m，控制南瓜主藤保留40节，次藤保留3～4 节，每株只保留一个果实。
13.优选的，每株保留的一个果实为主茎上的第二个果实。
14.可选的，每株施复合肥8～12kg、caso4肥8～12kg、菜籽饼5～15kg、牛 粪15～25kg；复合肥中n：p2o5：k2o＝15：15：15。
15.所述方法提高南瓜光合作用、肌醇半乳糖苷合成酶(gols)、棉子糖合 成酶(rs)、水苏糖合成酶(sts)及碱性
ɑ-半乳糖苷酶(aga)的活性 和表达量。
16.所述方法中喷施naa和ebr的组合调节剂，用于提高果实中蔗糖、葡 萄糖和果糖的含量。
17.本发明用浓度20mg
·
l-1
的naa+1.0mg
·
l-1
的ebr分别在巨型南瓜定植 后20d+开花当天+花后10d+花后20d喷洒叶片和果实，增加南瓜果实重量 的效应是从源(叶片)——运输(韧皮部汁液)——库(果实)中各部位全 方位协同作用的结果。在源(叶片)中，喷施naa+ebr可以显著提高了叶 片的光合速率、气孔导度和蒸腾速率，促进同化物的合成和水分的供给；同 时促进gols、rs、sts基因表达与酶活性，提高南瓜叶片水苏糖的合成； 在运输(韧皮部汁液)中，喷施naa+ebr提高果柄韧皮部汁液中水苏糖， 蔗糖的以及开花0d到花后20d的葡萄糖和果糖的浓度，提高了同化物通过 果柄向果实运输的效率；在库(果实)中，naa+ebr处理提高了aga活 性和表达量，提高果实中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量，有利于为同化物的代 谢，为南瓜生长提供物质能量，最终促进其果实增大。
18.本发明的有益效果：本发明通过对南瓜生长发育的不同时期喷施生长 调节剂进行调控，加快南瓜的快速膨大。巨型南瓜的培植成功，不仅展示 了先进的现代农业育种技术和栽培技术，成为农业科普教育的亮点，而且 丰富了景区农业观光旅游内容，具有较高的商业价值。巨型南瓜的价值与 其重量密不可分，增加其单果重可以提高南瓜的观赏性和价格，增加农业 园区的游客数，增加了农民收入，带来了一定经济价值和社会效益，有很 好的产业化应用前景。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对 实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员 来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附 图。
20.图1为本发明喷施不同浓度naa和ebr对巨型南瓜单果重的影响示意 图；
21.图2为本发明naa和ebr的施用时期和次数对巨型南瓜单果重的影响 示意图；
22.图3为本发明喷施naa和ebr对巨型南瓜光合特性的影响示意图；
23.图4为本发明喷施naa和ebr对巨型南瓜糖代谢相关酶基因表达量和 活性的影响示意图；
24.图5为本发明喷施naa和ebr对巨型南瓜叶片中可溶性糖含量的影响 示意图；
25.图6为喷施naa和ebr对巨型南瓜果柄韧皮部汁液中可溶性糖含量的 影响示意图；
26.图7为喷施naa和ebr对巨型南瓜碱性
ɑ-半乳糖苷酶表达量和活性的 影响示意图；
27.图8为喷施naa和ebr对巨型南瓜果实中可溶性糖含量的影响示意 图。
具体实施方式
28.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实 施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
29.需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科 学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
30.1.材料与方法
31.1.1材料
32.供试材料为atlanticgiant巨型南瓜，属于印度南瓜品种，种子购于美 国(the sustainable seed company，covelo，california，usa)。
33.常规育苗，待幼苗长至3叶1心时定植于扬州市沙头镇乐活庄园农业生 态园塑料大棚中。根据巨型南瓜种植方法langevin等(2003)修改。每棵 植株挖一个50cm深、1～1.5m直径的定植穴。每株施复合肥10kg(n： p2o5：k2o＝15：15：15)、caso4肥10kg、菜籽叶10kg、牛粪20kg。株行 距5m
×
2m。主藤保留40节，次藤保留3～4节，每株只保留一个果实(即 主茎上的第二个果实)。
34.1.2方法
35.1.2.1 naa和ebr不同浓度组合试验设计
36.在果实快速膨大期(花后20d)用不同浓度naa和ebr喷洒叶片(正 反面)和果实，喷洒至有水滴开始落下为止，以蒸馏水为对照(体积分数为 0.1％的吐温-20)，每个处理重复3次，每个重复20株。naa和ebr的浓 度具体设计见表1。
37.表1 naa和ebr不同浓度组合
[0038][0039][0040]
1.2.2 naa和ebr施用时期和次数试验设计
[0041]
选取naa、ebr随机组合实验中单果重增加最多的组合，设置不同喷 施次数和喷施时间，进一步研究naa、ebr对巨型南瓜重量的增加效应， 具体试验设计见表2。
[0042]
表2激素的施用时期和次数
[0043][0044]
注：“—”表示未喷施激素：s：spraying，喷施激素。
[0045]
1.2.4单果重的测定
[0046]
在南瓜果实停止生长时采收，并电子秤测量单果重，最终结果为60个 果实的平均值。
[0047]
1.2.3样品的采集
[0048]
处理后每10d取样一次，取留瓜节位叶片和果实，每5片叶或果实为1 次重复，共3次重复。果柄韧皮部汁液的采集，按照mitchell等(1992)的 方法，将果梗切成叶片，用毛细管从植物侧采集韧皮部汁液。为减少切面 细胞和木质部汁液的污染，丢弃前2秒收集的汁液。所有样品取完后立即 放入液氮中冷冻，于-80℃冰箱中保存备用。
[0049]
1.2.4叶片光合特性测量方法
[0050]
选取开花后0d和20d的结果节位的叶片进行光合指数测定。利用便携 式li-6400xt光合系统和标准透明叶室(美国li-cor公司)测量光合速率(pn)、细胞间co2浓度(ci)、气孔导度(gs)和蒸腾速率(tr)。测定 时间为上午8点至下午4点，每隔2h测定一次，共5次，每个品种测定5 株。
[0051]
1.2.5糖代谢相关酶基因表达量测定
[0052]
使用rnaiso
tm plus(takara，日本)试剂盒，按照说明书要求对南瓜 叶片和果实进行总rna提取。反转录使用one-step gdnaremoval and cdna synthesis super mix试剂盒(北京全式金生物技术，中 国)参照试剂盒说明书进行cdna合成。qrt-pcr利用ex试剂盒(bio-rad，美国)并按产品说明书操作。反应体系为 ex taq
tm
ⅱꢀ
12.5μl，cdna 1.0μl，引物各0.5μl，加ddh2o至 20μl。使用cfx96
tm
实时定量pcr仪(bio-rad，美国)，反应程序为：94℃ 2min；94℃10s，60℃5s，35个循环；然后以0.5℃
·
min-1
的速率从65℃缓 慢升温至95℃。采用南瓜内参基因标准化数据，并用2-δδct
方法计算基因的 相对表达量。所用引物如表3所示。
[0053]
表3 qrt-pcr引物
[0054][0055]
1.2.6糖代谢相关酶提取及酶活测定方法
[0056]
0.5g冷冻研磨好的样品，加入2ml提取液(50mmol
·
l-1
hepes-naoh 缓冲液(ph7.0)、2mmol
·
l-1
dtt、10mg
·
ml-1
pvp)，匀浆；静置15min， 在18000
×
g下离心30min；保留上清液，用含有25mmol
·
l-1
hepes-naoh和1mmol
·
l-1
dtt的缓冲液透析过夜，然后收集酶液备用。
[0057]
测定方法参照li等(2011)和wang等(2012)的方法。gols、rs和 sts活性测定：200μl反应体系均含有100mmol
·
l-1
hepes-naoh缓冲液 (ph7.0)，20mmol
·
l-1
β-巯基乙醇，5mmol
·
l-1
mgcl2，4mmol
·
l-1
dtt，但 不同的酶需要加入不同的反应底物；测定的gols活性的反应体系还含有 40mmol
·
l-1
蔗糖，20mmol
·
l-1
肌醇和5mmol
·
l-1
udp-半乳糖；测定rs活性 的反应体系则含有20mmol
·
l-1
肌醇半乳糖苷；测定sts活性的反应体系则 包含40mmol
·
l-1
棉籽糖，20mmol
·
l-1
肌醇半乳糖苷。随后加入50μl酶液， 在30℃下水浴3h，沸水中煮沸5min，冷却后，利用hplc进样测定， gols、rs、sts的活性分别以生成的肌醇半乳糖苷量、棉籽糖量和水苏糖 量来表示。
[0058]
aga活性的测定：酶液的提取参照miao等(2007)的方法。具体为称取 0.25g冷冻研磨好的组织样品，加入1ml提取液(50mmol
·
l-1
hepes-naoh缓冲 液(ph7.4)、2mmol
·
l-1
mgcl2、1mmol
·
l-1
edta、1mmol
·
l-1
ddt)匀浆，静 置15min，18000g
·
min-1
离心30min；取上清液，加入5％(w/v)peg6000，待 其充分溶解后，18000g
·
min-1
，离心30min；取上清液加入50％(w/v)的 peg6000，再次离心；弃上清液，用缓冲液(25mmol
·
l-1
hepes-naoh， 1mmol
·
l-1
dtt)重溶沉淀，并透析过夜。测定参照wang等(2016)的方法，以 水苏糖为底物，100μl反应体系包含100mmol
·
l-1
hepes-naoh缓冲液(ph7.4) 和16mmol
·
l-1
水苏糖。向反应体系中加入30μl酶提取液反应15min后，加入 100μl 5％(w/w)naco3，煮沸5min终止反应。利用hplc测定消耗的水苏糖 的量表示酶的活性。
[0059]
1.2.7可溶性糖提取及测定
[0060]
南瓜组织中可溶性糖的提取和测定参照miao等(2007)的方法，称取0.3g样品充分研磨，加入10ml 80％乙醇提取10min，6000g
·
min-1
下离心 15min，取上清液。置于旋转蒸发仪40℃下减压蒸干，用ddh2o溶解，加 2.5ml氯仿，振荡，离心除去有机相。用0.1mol
·
l-1
的naoh将水相ph调 至7.0，再次减压蒸干，最后用1ml ddh2o溶解，经0.45μm针式过滤器过 滤。在与标准品相同的色谱条件下，hplc进样测定，利用外标法计算水 苏糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖和果糖等可溶性糖的含量。色谱柱为agilenthi-plex ca(duo)柱(300mm
×
6.5mm)，流动相为超纯水，柱温80℃，流 速0.5ml
·
min-1
，进样体积5μl，以保留时间定性，以峰面积定量。
[0061]
1.2.8数据处理
[0062]
试验数据采用microsoft excel软件进行整理，并用spss统计软件进行 差异显著性分析，用graphpad prism9.0绘图展示。
[0063]
2.结果与分析
[0064]
2.1喷施naa和ebr对巨型南瓜单果重的影响
[0065]
在巨型南瓜花后20d喷施不同浓度naa和ebr，并用喷施清水作对照 (control，con)，结果发现naa和ebr喷施的南瓜单果重均高于对照组 (87.6kg)，并且除了喷施t1(0.5mg
·
l-1
etr)和t4(10mg
·
l-1
naa)的 单果重量与对照没有显著差异，其他13个处理的单果重量均达到的显著差 异。各处理间果实单果重最高为喷施t10(20mg
·
l-1
naa+1.0mg
·
l-1
etr)， 约为112.4
±
3.8kg，约为对照果实重量的1.28倍；其次为喷施t14 (30mg
·
l-1
naa+1.0mg
·
l-1
etr)和t11(20mg
·
l-1
naa+1.5mg
·
l-1
etr)， 单果重分别约为107.1kg和106.3kg，说明采用naa+ebr喷施南瓜叶片和 果实，对于促进果实的重量有显著作用，处理t10的效果最为明显(图1)。
[0066]
进一步对naa和ebr的施用时期和次数在增加巨型南瓜单果重的效应 的研究发现，采用20mg
·
l-1
naa+1.0mg
·
l-1
ebr喷洒叶片和果实，并且在 定植后20d+开花当天+花后10d+花后20d喷洒(t18)对于促进果实的重量 有显著作用，该处理的单果重约为127.2
±
3.6kg，与对照相比增加了 44.1％，与花后20d喷施1次(t10)相比增加15.3％。同时还发现喷施naa 和ebr增加南瓜果实单果重的效应，并不与喷施的次数成正比，喷施5次 (定植后20d、开花当天、花后10d、花后20d和花后30d各喷施1次， t19)的单果重低于处理t18，两者没有到达显著差异(图2)。但是江苏 省地区夏季高温过高，南瓜的生育期较短，严重制约了巨型南瓜果实的生 长，这可能是本发明中南瓜的重量与世界纪录中报道的南瓜重量相差较多 的一个原因。
[0067]
2.2喷施naa和ebr对巨型南瓜光合特性的影响
[0068]
进一步，分析了喷施4次20mg
·
l-1
naa+1.0mg
·
l-1
ebr(t18)对巨型 南瓜开花当天和花后20d光合特性的影响(图3)。花后20d光合速率，气 孔导度和蒸腾速率高于开花当天，表明在果实快速膨大期，需要生产更多 的同化物，同时也需要供给更多的水分；喷施4次20mg
·
l-1
naa+1.0mg
·
l-1 ebr显著提高了叶片的光合速率，气孔导度和蒸腾速率，但对胞间co2浓 度无显著影响，促进同化物的合成和水分的大量供给，有利于南瓜的膨 大。
[0069]
2.3喷施naa和ebr对巨型南瓜糖代谢相关酶基因表达量和活性的影 响
[0070]
巨型南瓜果实所在节位叶片中cmgols1、cmrs、cmsts基因表达与酶 活性在南瓜果实生长发育过程中的变化趋势基本一致(图4)。cmgols1在 果实发育前期表达较高，50d后有所下降；cmrs在果实发育期间表达水平 维持在较平稳的水平，cmsts表达在果实进入快速生长期后有所上升，50d 后逐步降低。喷施4次20mg
·
l-1
naa+1.0mg
·
l-1
ebr可以显著提高了 cmgols1、cmrs、cmsts基因的表达和酶的活性，表明喷施激素可以促进 南瓜叶片水苏糖的合成，并用于输出，供果实快速生长需要。
[0071]
2.4喷施naa和ebr对巨型南瓜叶片中可溶性糖含量的影响
[0072]
随着果实的生长发育，南瓜结果部位叶片中水苏糖、棉子糖、蔗糖、 葡萄糖和果糖的含量随着果实发育逐步下降，但是各种糖的开始下降的时 间点有所不同(图5)。水苏糖和棉子糖的含量在果实发育的前期保持较高 的水平，果实发育50d后两者的含量明显降
低，但是降低的程度也不一 样，果实发育60d时棉子糖平均下降了约42.3％，而水苏糖平均下降了 19.6％。蔗糖在南瓜果实发育30d后，逐渐降低，后期略有增加，但是不明 显。从开花当天，葡萄糖和果糖的含量开始明显降低，葡萄糖在到花后30d 降低到最小值，果糖则是在花后20d就降低到最小值，在南瓜的后期发育 过程中，两者基本不发生变化。喷施4次20mg
·
l-1
naa+1.0mg
·
l-1
ebr可 以提高了叶片中水苏糖的含量，在果实发育的后期，虽然水苏糖下降明 显，但是处理后的下降了15.1％，对照则下降了24.2％。但是喷施naa和 ebr对其他可溶性糖的浓度无显著影响。
[0073]
2.5喷施naa和ebr对巨型南瓜果柄韧皮部汁液可溶性糖含量的影响
[0074]
南瓜果柄韧皮部汁液中水苏糖和蔗糖含量的对照组和处理组变化趋于 一致，随着南瓜果实的生长发育，总体呈上升趋势，且喷施naa和ebr组 中水苏糖和蔗糖明显高于对照组，分别增加了约1.3～3.1mg
·
g-1
和 0.8～2.5mg
·
g-1
。棉子糖在南瓜发育过程中，呈先上升后下降的趋势，在花后 20d达到最大值，在花后60d达到最小值，然而喷施naa和ebr对其没有 影响。葡萄糖的含量在南瓜发育过程中的变化与棉子糖的变化趋势一致， 但是在果实发育的前30d，喷施naa和ebr可以增加葡萄糖的含量。果糖 含量总体呈下降趋势，并且在花后30d就达到了0值，在过发育的最初阶段 (花后10d)，喷施naa和ebr韧皮部汁液的含量高于对照(图6)。以 上结果表明naa+ebr处理可提高果柄韧皮部汁液中水苏糖，蔗糖的以及 开花0d到花后20d的葡萄糖和果糖的浓度，说明此处理提高了同化物的运 输效率。
[0075]
2.6喷施naa和ebr对巨型南瓜果实中碱性
ɑ-半乳糖苷酶表达量和活 性的影响
[0076]
在正常条件下，南瓜果实中碱性
ɑ-半乳糖苷酶1(cmaga1)和碱性
ɑ
‑ꢀ
半乳糖苷酶2(cmaga2)的表达在果实发育过程中几乎无明显变化，但aga 活性先升高后降低(图7)。外源施用naa+ebr的南瓜果实中cmaga1 和cmaga2的表达水平有增加的趋势，并且cmaga2的增加量更明显，同 时aga的活性也显著增加，表明naa+ebr可以增强南瓜同化物卸载能 力，增加库强。
[0077]
2.7喷施naa和ebr对巨型南瓜果实中可溶性糖含量的影响
[0078]
南瓜果实中水苏糖呈向上升后下降的趋势，在南瓜发育20d是达到最 大值，随后迅速下降，在花后60d降至最低，而棉子糖的则先下降再上 升，在花后20d达到最大值，随后有有一定程度的增加；然而喷施naa和 ebr对这两种rfo的含量没有影响。南瓜果实的发育过程中，果实中蔗糖 和果糖含量与水苏糖的变化趋势一致；葡萄糖含量在花后10d就达到了最 大值，之后逐渐下降，虽然有局部上升，但总体呈现下降趋势。果实中蔗 糖，葡萄糖与果糖的含量都是处理组显著高于对照组(图8)。以上结果表 明喷施naa和ebr显著提高了果实中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量，但对水 苏糖与棉子糖无显著影响。说明naa+ebr喷洒叶片和果实的处理有利于 同化物的代谢，为果实生长提供物质能量，促进其快速膨大，增加果实的 重量。
[0079]
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例 性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本 发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行 组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的 许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
[0080]
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这 样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任 何省略、修改、等同替换、
改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。