一种伪无菌大鼠模型的构建方法与流程

1.本发明涉及一种伪无菌大鼠模型的构建方法。


背景技术：

2.肠道是人体面积最大的“器官”，容纳了数以万亿计的微生物。此前研究表明，肠道微生物群不仅可以以益生菌的形式直接保护生理健康，还可以通过其代谢产物间接影响机体功能，因此对肠道微生物群的研究至关重要。国际上常用构建无菌动物模型或口服抗生素鸡尾酒的方法，移除或抑制肠道微生物群以研究肠道微生物群的功能。
3.现有技术中构建无菌动物模型的方法为：从母体大鼠中通过无菌剖腹取出第一代无菌大鼠幼体，后经过一系列完全无菌的培养系统，使得第一代大鼠在无菌环境下饲养长大，长大后继续繁育至第二代即无菌动物模型构建成功，整个过程需要严格控制无菌条件。
4.但无菌动物模型的构建存在饲养条件苛刻、实验周期漫长、经费花销极高等缺点，而抗生素往往需要连续灌胃21天以上才可以发挥效用。长期灌胃抗生素不仅容易导致耐药微生物群增加，还会对肠组织产生损伤，例如空肠小肠绒毛脱落、肠蠕动速率减慢等。此外，如果后续进行菌群再定植还会大大降低菌群的定植效率。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种新的伪无菌大鼠模型的构建方法，并从大鼠小肠病理学损伤、肠道菌群稳定性方面对此方法进行评估。本发明通过大鼠给药一定天数的灌肠液与四联抗生素，建立一种实验周期较短，经费花销低，菌群稳定，造模成功率高且对大鼠肠组织无病理损伤的伪无菌大鼠模型建造方案，为后续肠道菌群功能研究提供一种定量化研究工具。
6.本发明的第一个目的是提供一种伪无菌大鼠模型的构建方法，包括以下步骤：s1，采用复方聚乙二醇电解质散混合乳果糖口服液灌胃大鼠以清除大鼠肠内容物；s2，清除大鼠肠内容物后，每隔50-70min灌胃一次四联抗生素溶液，连续8-10次；s3，之后，每天灌胃四联抗生素溶液两次，连续灌胃至大鼠体重变化稳定，粪便dai评分为0后，停止灌胃。
7.作为优选方案，步骤s1中，所述复方聚乙二醇电解质散混合乳果糖口服液的配制方法为：用水将乳果糖口服液稀释，得到混合液，然后将复方聚乙二醇电解质散溶于所述混合液；每份复方聚乙二醇电解质散由以下物质组成：a 剂：聚乙二醇4000，13.125 g；b 剂：碳酸氢钠0.1785 g，氯化钠0.3507g，氯化钾 0.0466 g。
8.作为优选方案，所述乳果糖口服液、复方聚乙二醇电解质、水的用量比为：30ml：1份：500ml。
9.作为优选方案，步骤s1中，所述采用复方聚乙二醇电解质散混合乳果糖口服液灌
胃大鼠具体为：第一天连续灌胃8-10次，第二天连续灌胃3-5次，每次间隔50-70min，每次1.8-2.2ml。
10.作为优选方案，步骤s2中，每1l所述四联抗生素溶液的配制方法为：将1.125g阿莫西林克拉维酸钾片、50mg注射用替加环素、400mg盐酸莫西沙星和1.67g/l奥硝唑溶于无菌注射用水中，定容至1l。
11.作为优选方案，步骤s2中，按大鼠体重每次灌胃四联抗生素溶液9-11ml/kg。
12.作为优选方案，步骤s3中，每天早晚灌胃一次四联抗生素溶液，按大鼠体重每次灌胃四联抗生素溶液9-11ml/kg。
13.作为优选方案，步骤s3中，连续灌胃四联抗生素溶液4天。
14.作为优选方案，构建过程中，将大鼠饲养于带灭菌垫料、紫外线照射的单独隔间内，自由饮用灭菌饲料及灭菌注射用水。
15.本发明的第二个目的是提供一种伪无菌大鼠模型，是应用上述的方法构建得到的。
16.本发明的技术关键点在于灌肠液配比，采用大鼠安全剂量的复方聚乙二醇电解质散混合乳果糖口服液，第一天连续灌胃9h，第二天连续灌胃4h，每小时一次，每次2ml，清理大鼠的肠内容物之后再给予大鼠安全剂量的四联抗生素：阿莫西林克拉维酸钾片（1.125g/l）+注射用替加环素（50mg/l）+盐酸莫西沙星（400mg/l）+奥硝唑（1.67g/l）每隔1h灌胃一次，连续灌胃9h，清除或抑制肠道内不同种类的菌群。在无菌隔离室内正常饮灭菌后的食物和水，连续灌胃小剂量抗生素4天，减少菌群再定植。至大鼠体重变化稳定，粪便dai评分为0时，即第7天，停止灌胃抗生素，正常饮用灭菌饲料及用水。第8天，第9天，第10天，连续进行革兰氏染色，检测模型稳定性。
附图说明
17.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1为不同药物处理前后大鼠体重对比。
18.图2为各组大鼠评分统计图。
19.图3为各组大鼠小肠、结肠解剖示例图。其中，a组为禁食12h组，b组为舒泰清处理组，c组为乳果糖+舒泰清处理组。
20.图4为各组大鼠盲肠生物量对比图。
21.图5为各组大鼠盲肠解剖示例图。其中，a组为乳果糖+舒泰清处理组，b组为舒泰清处理组，c组为禁食12h组。
22.图6为本发明的伪无菌大鼠模型的建立方法的流程图。
23.图7为各组大鼠体重变化折线图。
24.图8为各组大鼠小肠组织he染色镜检图（200
×
）。
25.图9为各组大鼠盲肠解剖图。
26.图10为各组大鼠粪便样品革兰氏染色镜检图（100
×
）。
27.图11 为各组大鼠粪便样品16srna测定科水平物种组成柱状图。
28.图12为各组大鼠粪便16srna组间alpha多样性指数盒状图。
29.图13为正常空白组大鼠与伪无菌模型组大鼠硝苯地平药时曲线图及药代动力学参数。
具体实施方式
30.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
31.实施例1大鼠灌肠液筛选过程实验名称:灌肠液筛选实验实验动物：18只雄性，wistar大鼠，体重为200
±
20g。
32.实验药物前处理：复方聚乙二醇电解质散（舒泰清）溶液+乳果糖口服液的配制：用无菌注射用水将30ml乳果糖口服液稀释至500ml，然后将1包复方聚乙二醇电解质散溶于上述混合物。
33.每包复方聚乙二醇电解质散（舒泰清）由以下物质组成：a剂：聚乙二醇4000，13.125g；b剂：碳酸氢钠0.1785g，氯化钠0.3507g，氯化钾0.0466g。
34.复方聚乙二醇电解质散（舒泰清）溶液的配制：将1包复方聚乙二醇电解质散用水稀释至500ml。
35.实验方案：18只大鼠随机分为每组6只，分别进行如下处理：1.灌胃复方聚乙二醇电解质散溶液+乳果糖口服液，每次2ml，共灌胃12h；2.灌胃复方聚乙二醇电解质散溶液，每次2ml，共灌胃12h；3.禁食12h，所有大鼠自由饮用纯化水。
36.检测指标：1.不同药物处理前后大鼠体重对比见图1。
37.图1为不同药物处理前后大鼠体重对比。
38.2.肠道清洁等级评分量表见表1（每段肠取6-8cm，从上往下，上面是小肠，下面是结肠）。
39.表1肠道清洁等级评分量表评分描述0肠道内可有澄清液体、但无粪便残留1少量浑浊液体、粪便2存在浑浊液体、粪便，容易漂洗干净3有粪便残留，生理盐水可漂洗干净4有固体粪便、不易漂洗干净 3.各组评分统计图各组大鼠肠解剖后请三人进行评分，最终单个大鼠肠内清洁度评分值取三次评分的平均值（n=6）。
40.图2为各组大鼠评分统计图。
41.图3为各组大鼠小肠、结肠解剖示例图。其中，a组为禁食12h组，b组为舒泰清处理组，c组为乳果糖+舒泰清处理组。
42.4.各组大鼠盲肠生物量对比图
大鼠盲肠生物量定义为盲肠内每500μl液体中含有的固体质量。实验结果见图4。
43.图4为各组大鼠盲肠生物量对比图。
44.图5为各组大鼠盲肠解剖示例图。其中，a组为乳果糖+舒泰清处理组，b组为舒泰清处理组，c组为禁食12h组。
45.综上所述，三种处理方法对大鼠小肠、结肠、盲肠的内容物均有一定清除作用，其中乳果糖与舒泰清联用效果最佳，大鼠肠道清洁评分最低。因此，本实验后续使用乳果糖与舒泰清联用作为灌肠液配方。
46.实施例1 建立大鼠伪无菌动物模型1.实验动物及药物：受试动物：spf级健康雄性wistar大鼠（江苏华创信诺医药科技有限公司，许可证号：scxk(苏)2020-0009）实验药物：复方聚乙二醇电解质散溶液（舒泰神生物制药有限公司，商品名“舒泰清”）；乳果糖口服液（四川健能制药有限公司）；阿莫西林克拉维酸钾片（中诺药业）；注射用盐酸莫西沙星（天津红日药业股份有限公司）；奥硝唑（四川科伦制药有限公司）；注射用替加环素（湖南塞隆药业有限公司）；氨苄西林胶囊（珠海联邦制药股份有限公司），硫酸新霉素（安徽佰斯特生物科技有限公司）；甲硝唑片（华中药业股份有限公司）；盐酸万古霉素（南京生利德生物科技有限公司）。
47.复方聚乙二醇电解质散溶液+乳果糖口服液的配制：用无菌注射用水将30ml乳果糖口服液稀释至500ml，然后将1包复方聚乙二醇电解质散溶于上述混合物。
48.每包复方聚乙二醇电解质散由以下物质组成：a 剂：聚乙二醇4000，13.125 g；b 剂：碳酸氢钠0.1785 g，氯化钠0.3507g，氯化钾 0.0466 g。
49.本发明伪无菌模型组中使用的四联抗生素溶液的配制：将1.125g阿莫西林克拉维酸钾片、50mg注射用替加环素、400mg盐酸莫西沙星和1.67g/l奥硝唑溶于无菌注射用水中，定容至1l。
50.文献模型组使用的四联抗生素溶液的配制：将1 g/l氨苄西林、1g/l硫酸新霉素、1 g/l甲硝唑和0.5 g/l盐酸万古霉素溶于无菌注射用水中，定容至1l。
51.复方聚乙二醇电解质散溶液+乳果糖口服液、四联抗生素溶液均为使用时现场配制。
52.2.实验方法与结果：2.1.动物分组：共计24只spf级雄性wistar大鼠，体重控制在200g
±
20g，按照空白对照组8只、伪无菌模型组8只，文献模型对照组8只随机分配。
53.2.2.实验过程：第一天，大鼠称重，对伪无菌模型组大鼠灌胃复方聚乙二醇电解质散溶液+乳果糖口服液，每次2ml，每间隔 1h 灌一次，连续灌胃 9h，至大鼠排出清澈粪水时停止灌胃，自由饮用无菌注射用水。同天，文献模型对照组大鼠灌胃四联抗生素溶液，按大鼠体重每次10ml/kg，早晚各灌胃一次。所有大鼠均饲养于带灭菌垫料、紫外线照射的单独隔间内，自由饮用灭菌饲料及灭菌注射用水。
54.第二天，对伪无菌模型组大鼠灌胃复方聚乙二醇电解质散溶液+乳果糖口服液，每次10ml/kg，间隔0.5h，连续灌胃4次，至大鼠排出清澈粪水时停止灌胃。紧接着对伪无菌模
型组大鼠每隔1h灌胃一次四联抗生素溶液，按大鼠体重每次10ml/kg，连续灌胃9h。灌胃结束后换灭菌垫料，灭菌饲料，无菌注射用水饲养于紫外线照射30min后的单独隔间内。文献模型对照组与第一天一致，早晚灌胃四联抗生素溶液。
[0055] 第三天，将各组大鼠饲养于紫外线照射30min后的单独隔间内，使用灭菌饲料、灭菌垫料及灭菌注射用水。伪无菌模型组大鼠和文献模型对照组每天早晚灌胃四联抗生素，剂量同上。持续四天（即第三天至第六天）至伪无菌模型组大鼠体重变化稳定，粪便dai评分为0时，伪无菌模型组大鼠和文献模型对照组停止灌胃四联抗生素，自由饮用灭菌饲料及注射用水，每天称量大鼠体重，并在第7天-第10天连续采用灭菌冻存管收集大鼠粪便。第十天称量大鼠体重，收集粪便后，给药硝苯地平1.58mg/kg，采集500μl空白对照组及伪无菌模型组大鼠0.167,0.33,0.5,0.75,1,1.5,2,4,6,8,12,和24小时的眼眶静脉丛血，离心取上层血浆lc/ms分析，药代实验结束后解剖取大鼠肠组织及肠内容物进行后续分析。
[0056]
其中，粪便dai评分具体标准为：注：*正常：成型；松散：不黏附于肛门的糊状，半成型大便；稀便：可黏附于肛门的稀水样便。
[0057]
dai=（体重下降+大便性状+大便出血）/3。
[0058]
3.实验结果3.1.大鼠体重变化分析大鼠体重变化见图7。
[0059]
图7为各组大鼠体重变化折线图。
[0060]
图7的体重折线图显示第一天给药复合灌肠液后大鼠体重显著降低，给药四联抗生素后，正常给予了大鼠灭菌水及饲料，因此大鼠体重开始缓慢升高，于第七天恢复至初始水平。给药四联抗生素后大鼠食欲未见明显下降，说明抗生素剂量合理，未出现大鼠毒副作用。
[0061]
3.2.大鼠肠组织病理切片分析大鼠肠组织病理切片分析见图8。
[0062]
图8为各组大鼠小肠组织he染色镜检图（200
×
）。其中，a组为空白对照组，b组为文献模型对照组，c组为伪无菌模型组。
[0063]
如图8所示，a组空白对照组大鼠，小肠上皮细胞结构清晰，隐窝结构完整，固有层无水肿。b组文献模型对照组大鼠及伪无菌模型组大鼠，小肠上皮细胞组织结构完整，杯状细胞因黏液分泌旺盛增多，潘氏细胞减少，炎性细胞浸润程度较轻，隐窝结构完整。综上所述，与空白对照组相比，文献造模方法及本发明的造模方法对大鼠小肠组织均没有产生明显病理学损伤。
[0064]
3.3.大鼠盲肠解剖图分析大鼠盲肠解剖图分析见图9。
[0065]
图9为各组大鼠盲肠解剖图。其中，a图为空白对照组，b图为文献模型对照组，c图为伪无菌模型组。
[0066]
无菌大鼠肠道内由于不含微生物，盲肠内粘液和未消化的纤维堆积较多，因此盲肠体积较正常大鼠有所增加。如图4所示，空白对照组大鼠盲肠组织长2.5cm，宽3cm，文献模型对照组大鼠肠组织长3.5cm，宽3.3cm，伪无菌模型组大鼠盲肠组织长4.5cm, 宽4.7cm，由图可知伪无菌模型组大鼠盲肠体积显著增加，且增加趋势相较文献模型对照组更加显著。从大鼠盲肠变化可知，大鼠伪无菌模型建立成功，且在盲肠内抑制肠道菌群的作用优于文献模型对照组。
[0067]
3.4.大鼠粪便革兰氏染色分析大鼠粪便革兰氏染色分析见图10。
[0068]
图10为各组大鼠粪便样品革兰氏染色镜检图（100
×
）。其中，a为空白对照组，b为伪无菌模型组造模8天，c为伪无菌模型组造模9天，d为伪无菌模型组造模10天，e为文献模型对照组造模8天，f为文献模型对照组造模9天，g组为文献模型对照组造模10天。
[0069]
如图10所示，空白对照组有大量的细菌，其中革兰氏阴性杆菌：革兰氏阳性杆菌数值约为10：1；与空白对照组相较，伪无菌模型组造模成功后总肠道菌群数量显著降低，革兰氏阴性菌与阳性菌的数量均维持在个位数；文献模型对照组菌群数量有所降低，但相较伪无菌模型组，总菌数较高。通过造模成功后连续3天的革兰氏染色可知，伪无菌模型组大鼠的肠道菌群数量在三天内可以保持较低水平，且三天内肠道菌群数量无显著性差异（p》0.05）。
[0070]
3.5.大鼠粪便16srna结果分析图11为各组大鼠粪便样品16srna测定科水平物种组成柱状图。横坐标是样本名称，纵坐标是注释到的物种相对丰度。该分类水平未注释到的和丰度在样品中低于0.5%的物种合并成others。图中，空白对照组中，柱状图由上到下依次表示：白粉菌科（erysipelotrichaceae）、毛蕨科（sutterellaceae）、消化链球菌科（peptostreptococcaceae）、紫菜科（porphyromonadaceae）、普氏藻科（prevotellaceae）、真杆菌科（eubacteriaceae）、毛螺菌科（lachnospiraceae）、瘤胃球菌科（ruminococcaceae）、乳酸杆菌科（lactobacillaceae）、其他（others）；伪无菌模型组中，柱状图由上到下依次表示：肠杆菌科（enterobacteriaceae）、肠球菌科（enterococcaceae）。
[0071]
如图11所示，与正常空白大鼠比，伪无菌模型组大鼠粪便微生物物种结构明显改变，物种类型显著下降（p《0.05）。
[0072]
图12为各组大鼠粪便16srna组间alpha多样性指数盒状图，反应了特定区域或生态系统内微生物的丰富度和均匀度。与正常空白大鼠比较，伪无菌模型组大鼠粪便微生物的alpha多样性显著降低（p《0.05）。
[0073]
3.6.正常空白组大鼠与伪无菌模型组大鼠硝苯地平药时曲线及药代动力学参数比较正常空白组大鼠与伪无菌模型组大鼠硝苯地平药时曲线及药代动力学参数比较见表2和图13。
[0074]
*p《0.05。
[0075]
图13为正常空白组大鼠与伪无菌模型组大鼠硝苯地平lc/ms药时曲线图。
[0076]
如图13所示，造模成功后的第三天通过lc-ms法检测各组大鼠硝苯地平药代动力学参数，与正常空白组大鼠相比，伪无菌模型组药时曲线下面积、达峰时间显著增加，这与文献记载肠道菌群对硝苯地平药代动力学参数的影响趋势一致（nature, 2019）。因此，本发明所述伪无菌模型可用于探究肠道菌群与药物药代动力学之间的相关性。
[0077]
综上所述，通过三组大鼠体重变化，病理情况，肠道菌群数量及种类的变化比较分析，本技术成功建立了一种新型、较稳定的伪无菌大鼠模型，对大鼠肠组织无病理损伤，可用于研究药物与肠道菌群具有普适性。
[0078]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。