一种低温冻存组织进行冰冻切片的方法和应用与流程

1.本发明属于冰冻组织切片技术领域，具体涉及一种低温冻存组织进行冰冻切片的方法和应用。


背景技术：

2.冰冻切片是一种借助低温冷冻快速将活体组织冻结或包埋至一定硬度，然后进行切片的病理实验技术，广泛运用于临床和科研。冰冻切片技术能快速制成切片标本，较好地保存细胞内的酶活性。同时，由于冰冻切片对抗原破坏性小，组织无明显收缩，可保存脂肪、类脂及各种酶的活性，在免疫组化或免疫荧光实验中也被广泛应用，在科研实验中有着不可取代的作用。要制作高质量的冰冻切片，需要在取材、组织冰冻包埋、切片及染色的每一个环节都充分掌握其技术要领，控制好各个操作步骤。冰冻切片质量的好坏直接影响实验结果，因此，制作高质量的冰冻切片是获得优质实验结果的关键。组织在冷冻过程中,由于受含水量、冷冻时间及温度等的影响，制作的冰冻切片可发生冰晶形成、切片皱褶、切片脱落、染色欠佳等问题，组织标本存放条件也会对组织内的抗原以及冰冻切片的组织形态产生一定影响。
3.目前冰冻切片操作中一般用经过冷冻包埋的组织进行切片，包埋剂可以为oct或胶水。一般将冷冻包埋组织立即切片，或将已经包埋好的组织样本保存于-80℃超低温冰箱中，切片时将样品取出，转入冰切机中缓冲30min后进行切片。但是，有时候由于实验前未考虑进行冰冻切片或由于时间紧急或取材量大等原因，一些组织未能及时冰冻包埋，而直接用冻存管或者锡箔纸包裹，放置于液氮或-80℃超低温冰箱中保存。这样低温冻存的组织如果直接取出进行包埋切片容易出现组织切片撕裂和破损的情况，影响组织形态，干扰染色结果的准确性，易造成错误判断，对病理诊断或科学研究均会造成一定不良影响。


技术实现要素：

4.针对现有技术中，所取材组织未包埋就投入液氮或-80℃冰箱冻存，使用时取出后直接进行冰冻包埋和切片，会造成组织切片碎裂、破损以及染色不均匀的问题。本发明提供了一种将未包埋低温冻存组织进行程序性复温后再包埋切片的方法和应用，即低温冻存的未包埋组织取出后，在包埋前进行一系列程序性复温的步骤，再进行冰冻切片，能有效解决低温冻存的未包埋组织应用于冰冻组织切片实验时出现的组织碎裂和破损的问题。
5.为实现上述目的，本发明一种低温冻存组织进行冰冻切片的方法，包括程序性复温、包埋和切片，具体包括以下步骤：
6.(1)程序性复温：
7.a.提前准备好转运盒，在-80℃冰箱预冷一晚，备用；
8.b.将低温冻存组织取出后放到预处理的转运盒；
9.c.将转运盒再放到-80℃冰箱中放置0.5-1h；
10.d.将转运盒放到-40℃冰箱中放置0.5-1h；
11.(2)包埋：将经程序性复温后的组织取出在干冰上用包埋剂进行包埋；
12.(3)切片：将包埋好的组织放置于冰切机内平衡0.5-1h后进行切片。
13.程序性复温的原理为：通过逐步改变组织存放环境，让组织温度逐渐、均匀的改变，不会因为环境的改变而急剧升高。此过程要严格控制低温保存的未包埋组织在复温过程中的温度，使其温度回升均匀，不发生急剧升温(温度跨度过大)或不均匀升温而形成冰晶及其他问题，以保证组织进行切片后能有较好的形态。
14.一般情况下，对于低温冻存未包埋冻存的组织，会直接从低温存储处转移至干冰上进行包埋，中间没有复温步骤，而此方法会造成冰冻切片碎裂和破损以及后续染色不均等问题。而为了解决以上问题，实现对低温冻存未包埋冻存组织在冰冻组织切片后形态良好和染色均匀的目的，发明人经过大量试验，发现通过将未包埋低温冻存组织从存储处取出后进行程序性复温，冷冻组织取出后先放入预先处理的转运盒中，并将转运盒放到-80℃冰箱中一段时间，然后再将转运盒放入-40℃冰箱一段时间后，再进行包埋和切片，冻存组织经程序性复温过程，不会因为环境温度的突然变化而形成冰晶等，可有效解决上述问题，得到的冻存组织切片完整、形态良好，经染色后，组织结构清晰，基本可达到直接冷冻包埋组织立即切片的效果。
15.进一步的，上述技术方案中，所述低温冻存组织为液氮保存的未包埋组织或-80℃保存的未包埋组织。
16.进一步的，上述技术方案中，低温冻存组织为液氮保存的未包埋组织时，在转运组织前将预处理的转运盒再放入液氮中处理1.5-2.5h。本技术方案中在使用前将细胞转运盒放入液氮中进行预处理，可使得细胞转运盒的环境更接近于液氮，冻存组织取出后不至于因环境的快速转变而受影响。
17.进一步的，上述技术方案中，所述转运盒的温变速率≤1℃/min，所述转运盒为细胞转运盒或磁珠转运盒。本发明选择温变速率较为缓慢的转运盒，可使得冻存组织复温过程温度变化缓慢、均匀，不会因为温度急剧变化而影响组织的内部结构变化。
18.进一步的，上述技术方案中，所述包埋剂为oct。
19.进一步的，上述技术方案中，所述切片厚度为6-10μm。
20.本发明还提供一种由上述改进后的方法在低温冻存的未包埋组织用于冰冻组织切片中的应用。该改进方法还可以用于其它低温冻存的未包埋组织，并不限于液氮保存或-80℃保存的未包埋组织。
21.本发明具有的有益效果是：
22.本发明通过将低温冻存的未包埋组织从存储处取出后进行程序性复温，再进行冰冻包埋和切片，可有效解决低温冻存的未包埋组织应用于冰冻组织切片实验时出现组织碎裂和破损的问题，经复温处理后的冰冻组织切片完整性好、形态良好、均匀；
23.本发明改进后的方法，操作简单，对低温冻存的未包埋组织的冰冻组织切片进行染色形态良好、组织结构显示清晰；
24.本发明方法用于因实验前未考虑进行冰冻切片，或由于时间紧急，或取材量过大等原因导致的一些组织未能及时冰冻包埋而直接用冻存管或者锡箔纸包裹后放置于液氮或-80℃超低温冰箱中保存的材料，避免组织切片撕裂和破损的情况，为病理诊断或科学研究解决材料失真问题，提高判断的准确性。
附图说明
25.图1为本发明实施例1中100倍显微镜下冰冻切片染色显微照片；
26.图2为本发明实施例2中100倍显微镜下冰冻切片染色显微照片；
27.图3为对比例1中100倍显微镜下冰冻切片染色显微照片。
具体实施方式
28.下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例涉及的原料若无特别说明，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。
29.以下实施例中未包埋组织均为小鼠肝脏。
30.下面结合实施例对本发明作进一步详细描述：
31.实施例1
32.一种在液氮中储存的未包埋组织进行冰冻切片的方法，包括以下具体步骤：
33.(1)程序性复温：
34.a.提前准备好细胞转运盒，在-80℃冰箱预冷一晚，备用；
35.b.使用前将细胞转运盒再在液氮中预处理2h，将低温冻存组织取出后放到预处理的细胞转运盒；
36.c.将细胞转运盒再放到-80℃冰箱中放置0.5h；
37.d.将细胞转运盒放到-40℃冰箱中放置0.5h；
38.(2)包埋：将经程序性复温后的组织取出在干冰上用包埋剂oct进行包埋；
39.(3)切片：将包埋好的组织放置于冰切机内平衡0.5h后进行切片。
40.将所得切片经常规方法染色后，在100倍显微镜下观察并拍照，其照片如图1所示。从图1可以看出，经染色后的切片完整度高，形态良好、均匀，组织结构显示清晰。
41.实施例2
42.一种在-80℃冰箱中储存的未包埋组织进行冰冻切片的方法，包括以下具体步骤：
43.(1)程序性复温：
44.a.提前准备好磁珠转运盒，在-80℃冰箱预冷一晚，备用；
45.b.将低温冻存组织取出后放到预处理的磁珠转运盒；
46.c.将磁珠转运盒再放到-80℃冰箱中放置1h；
47.d.将磁珠转运盒放到-40℃冰箱中放置1h；
48.(2)包埋：将经程序性复温后的组织取出在干冰上用包埋剂oct进行包埋；
49.(3)切片：将包埋好的组织放置于冰切机内平衡0.5-1h后进行切片。
50.将所得切片经常规方法染色后，在100倍显微镜下观察并拍照，其照片如图2所示。从图2可以看出，经染色后的切片完整度高，形态良好、均匀，组织结构显示清晰。
51.对比例1
52.一种在-80℃冰箱中储存的未包埋组织进行冰冻切片的方法，包括以下具体步骤：
53.(1)包埋：将在-80℃冰箱中储存的未包埋组织取出在干冰上用包埋剂oct进行包埋；
54.(2)切片：将包埋好的组织放置于冰切机内平衡1h后进行切片。
55.将所得切片经常规方法染色后，在100倍显微镜下观察并拍照，其照片如图3所示。
从图3可以看出，经染色后的切片完整度较差，出现撕裂和破损，形态不平整，组织结构出现重叠或缺失的情况。
56.综合上述结果表明，本发明将低温冻存的未包埋组织从存储处取出后进行程序性复温后，再进行冰冻包埋和切片，能有效解决低温冻存的未包埋组织应用于冰冻组织切片实验时出现组织碎裂和破损的问题，经复温处理后的冰冻组织切片完整性好、形态良好、均匀；经染色后形态良好、组织结构显示清晰，与直接冷冻包埋组织立即切片的效果基本一致，该改进方法可应用于在低温冻存的未包埋组织用于冰冻组织切片中，效果好，可作为后续冻存组织形态学的挽救方法。
57.最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。