一种细胞冻存液及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.免疫治疗技术作为一种新兴的肿瘤治疗手段，具有杀瘤识别谱广、抗癌杀伤力高、毒副作用小等特点。免疫细胞类型主要有单核/巨噬细胞、cik、nk等。
3.以自然杀伤细胞(nk)为例，它是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的粒状淋巴细胞，能通过自身表面活化性受体与肿瘤细胞表面配体之间的作用，可不受mhc分子的限制，进而识别mhc-i类分子表达下调或缺失的肿瘤细胞，并发挥杀伤功能。由于nk细胞在外周血中仅占淋巴细胞的5％～15％，且肿瘤患者体内nk细胞的功能存在不同程度的缺失，导致难以产生良好的抗肿瘤效果，需要通过体外培养增加nk细胞的数量，以及不断增强nk细胞的杀伤功能等方法治疗。由于不能确保体外培养与临床使用时间节点的完全统一，故经常会出现因长时间培养而导致的成本增加、培养时间超过最佳对数生长期后细胞生长状态及活性的下降，从而影响nk细胞治疗效果的情况。
4.在现有技术中，主要是采用一种含不同比例的胎牛血清(fbs)、二甲基亚砜(dmso)和rpmi-1640的培养基的冻存液，来进行nk细胞体外培养后的保存，或是采用自体血清代替胎牛血清进行冻存。虽然前一种方法保存细胞的时间长，但是因为采用胎牛血清配制的冻存液，引入了外源蛋白，增加了病原污染的风险。而采用自体血清代替胎牛血清能够完全杜绝外源污染物感染的风险，但冻存后复苏培养的nk细胞活性较低。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种细胞冻存液及其制备方法和应用，能够用于免疫细胞冻存，保证细胞的活力和稳定性，配制好的细胞冻存液有效期为6个月以上，避免出现现配现用的冻存液对试剂的批次和安全难以控制的情况。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种细胞冻存液，所述细胞冻存液包括终浓度为0.15-0.40mol/l的海藻糖、终浓度为0.41-0.63mg/l的peg、终浓度为65-90ml/l的dmso、终浓度为35-65ml/l的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和基础培养基。
7.基础培养基包括rpmi1640溶液、mem溶液、dmem溶液、dmem/f12溶液等。
8.优选的，所述细胞冻存液不含血清、人血白蛋白。
9.优选的，所述细胞冻存液包括终浓度为0.16mol/l的海藻糖、终浓度为0.43mg/l的peg、终浓度为87.24ml/l的dmso、终浓度为64.33ml/l的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和基础培养基。
10.优选的，所述细胞冻存液包括终浓度为0.25mol/l的海藻糖、终浓度为0.53mg/l的peg、终浓度为76.02ml/l的dmso、终浓度为50.87ml/l的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和基础培养基。
11.优选的，所述细胞冻存液包括终浓度为0.38mol/l的海藻糖、终浓度为0.61mg/l的
peg、终浓度为66.26ml/l的dmso、终浓度为37.47ml/l的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和基础培养基。
12.本发明还提供了一种细胞冻存液的制备方法，步骤如下：
13.s1、将海藻糖溶解于0.9％氯化钠注射液中，过滤，配成1mol/l无菌溶液；
14.s2、将peg溶解于0.9％氯化钠注射液中，过滤，配成0.1g/l无菌溶液；
15.s3、按照一定浓度将步骤s1、s2所得的溶液与dmso、甘油混合均匀，用基础培养基定容，即得。
16.优选的，所述过滤为0.22μm的一次性针式过滤器过滤。
17.本发明还提供了一种细胞冻存液在冻存细胞或制备冻存细胞的产品中的应用。
18.优选的，冻存细胞的产品是维持冻存复苏后细胞的活性或制备维持冻存复苏后细胞的活性的产品。
19.优选的，所述细胞冻存液在免疫细胞中的应用。
20.因此，本发明采用上述一种细胞冻存液及其制备方法和应用，能够维持细胞活率和细胞表型；并且，产品成分中不含血清、人血白蛋白，没有外源污染物感染的风险，保证了产品安全；同时，所用试剂便宜、制备简单，制造成本低，能进行批量生产。
21.下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
22.图1是本发明的实验测试中经细胞冻存液处理后的nk细胞活率变化趋势图；
23.图2是本发明的实验测试中经细胞冻存液处理前的nk细胞中cd3、cd56基因的流式结果图；
24.图3是本发明的实验测试中经含血清冻存液处理第1个月时的nk细胞中cd3、cd56基因的流式结果图；
25.图4是本发明的实验测试中经含血清冻存液处理第6个月时的nk细胞中cd3、cd56基因的流式结果图；
26.图5是本发明的实验测试中经无血清冻存液处理第1个月时的nk细胞中cd3、cd56基因的流式结果图；
27.图6是本发明的实验测试中经无血清冻存液处理第6个月时的nk细胞中cd3、cd56基因的流式结果图。
具体实施方式
28.以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
29.实施例一
30.一种不含血清的细胞冻存液，包括终浓度为0.16mol/l的海藻糖、终浓度为0.43mg/l的peg、终浓度为87.24ml/l的dmso、终浓度为64.33ml/l的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和rpmi1640溶液。
31.实施例二
32.一种不含血清的细胞冻存液，包括终浓度为0.25mol/l的海藻糖、终浓度为0.53mg/l的peg、终浓度为76.02ml/l的dmso、终浓度为50.87ml/l的甘油；所述细胞冻存液
的溶剂为0.9％氯化钠溶液和rpmi1640溶液。
33.实施例三
34.一种不含血清的细胞冻存液，包括终浓度为0.38mol/l的海藻糖、终浓度为0.61mg/l的peg、终浓度为66.26ml/l的dmso、终浓度为37.47ml/l的甘油；所述细胞冻存液的溶剂为0.9％氯化钠溶液和rpmi1640溶液。
35.对比例一
36.一种含血清的细胞冻存液，以体积百分比计，包括90％血清、10％dmso。
37.实验测试
38.选取实施例一、二、三与对比例一中的细胞冻存液，其中冻存细胞为nk细胞，检测冻存液对nk细胞的活率与表面标志物的影响。步骤如下：
39.s1、采集脐血样本，用nk细胞培养试剂盒进行nk细胞培养扩增，达到试剂盒要求的培养天数后，对nk细胞进行收集；
40.s2、将收集到的nk细胞平均分为四份，分别用含血清冻存液(对比例一)和不含血清冻存液(实施例一、二、三)冻存细胞，冻存规格为：5
×
108个/4.5ml/支；
41.s3、冻存后的第1个月、第3个月和第6个月，从对比例一和实施例二这两组冻存液中各取1支复苏，进行细胞活率检测；
42.s4、对冻存时、冻存第1个月和冻存第6个月的细胞复苏后，从对比例一和实施例二这两组冻存液中各取1支，对cd3、cd56基因的表达进行流式细胞检测。
43.表1含血清冻存液处理的nk细胞中cd3、cd56基因的流式检测结果表
[0044] 冻存前第一个月第六个月cd3-cd56
+
91.9493.9798.03cd3
+
cd56
+
0.930.380.51cd3
+
cd56-0.970.720.03
[0045]
表2无血清冻存液处理的nk细胞中cd3、cd56基因的流式检测结果表
[0046] 冻存前第一个月第六个月cd3-cd56
+
91.9492.9197.23cd3
+
cd56
+
0.930.360.8cd3
+
cd56-0.970.980.06
[0047]
如图1-4、表1-2所示，冻存时与冻存一个月内复苏使用本冻存液进行细胞冻存与使用含血清冻存液进行细胞冻存的nk细胞活率变化相差不大，而在冻存一个月后再复苏的本冻存液中的细胞活率明显比含血清冻存液中的nk细胞活率更高；冻存复苏后，本冻存液中的cd3-cd56
+
nk样细胞的表达情况良好，表达率能保持90％以上，cd3
+
cd56
+
与cd3
+
cd56-nk样细胞的表达率较冻存前均有显著下降，且与含血清冻存液的表达情况相差不大。表明本冻存液对nk细胞冻存具有很好的保护作用，且不含血清与人血白蛋白，成分更安全，成本更低，且保证了冻存效果。
[0048]
因此，本发明采用上述一种细胞冻存液及其制备方法和应用，能够长期稳定冻存，维持高水平的细胞活率和细胞表型，保证了产品安全，具有制造成本低、适合大批量生产的特点。
[0049]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，
尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。