一种猪笼草组织培养工厂化生产方法

1.本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种猪笼草组织培养工厂化生产方法。


背景技术：

2.猪笼草(nepenthes mirabilis(lour.)druce)为猪笼草科猪笼草属多年生草本半木质藤本植物，又名雷公壶、猴子埕、猪仔笼等。猪笼草主要分布于亚洲中南半岛、非洲(马达加斯加)、澳大利亚北部和太平洋岛屿，全世界约有160种。猪笼草大部分品种分布在国外，我国仅有1种猪笼草(nepenthes.mirabilis)，分布于海南、广东西南部、广西等地，生长在海拔50-400米的沼泽、路边、山坡或林地。猪笼草叶形独特，颜色鲜艳，变态发育形成袋状捕虫笼，其笼体的形态和大小也各不相同，有的像小酒杯，有的像小罐子，观赏性极强，常用作微景观或盆栽观赏，造型别致，优雅宜人。此外，猪笼草还能诱捕昆虫，是目前食虫植物中最受人们欢迎的种类之一，具有极高的科普价值。该种类还有消炎止咳、清热利尿、消积化石等功效，也可煮水作为夏天的清凉茶饮，避暑消热。近年来，集观赏、药用和科普于一体的猪笼草越来越受到人们的关注，经济价值极大，市场应用前景宽广。
3.但是，其野生资源遭到严重破坏，数量急剧减少。因此，承需研究一种猪笼草组织培养工厂化生产方法，满足市场需求。猪笼草属于雌雄异株，不易授粉，结实率非常低，且种子萌发慢，发芽率低，扦插繁殖生根速度较慢，难成活，不能满足生产的要求。生产上，猪笼草的常用育苗方法是组织培养，但现有的组织培养育苗方法生根时间长，生根率低、能耗高，难以挽救匮乏的种质资源，填补市场空缺。因此，以猪笼草新芽或嫩茎为试验材料，使用液体培养基，以离体组织培养方法将种苗倒插接种在生根培养基，其生根速度大大提高，可迅速提高种苗的生产效率，满足种苗日益增长的市场需求，为规模化生产育苗提供一条有效途径。


技术实现要素：

4.本发明的目在于提供一种猪笼草组织培养工厂化生产方法，使用液体培养基，并且采用倒插接种生根的方式，可有效提高种苗生根率，并且大大缩短了猪笼草的生长周期，节省了大量的时间、人力、物力、财力，利于工厂化规模生产。
5.为实现上述目的，本发明技术方案如下：
6.一种猪笼草组织培养工厂化生产方法，所述方法包括如下步骤：
7.(1)外植体的选择与消毒处理
8.选择生长健壮、无病虫害的猪笼草植株，用洗涤灵加水浸泡全株15-25分钟，然后，自来水冲洗10-20分钟，用消毒剪刀剪掉多余叶片取带芽茎段作为外植体；将经过处理的猪笼草植株材料进行消毒处理；
9.(2)诱导培养
10.将步骤(1)的外植体用无菌滤纸吸干水分，接种到接种培养基上进行培养，培养7-8天外植体开始生长；
11.(3)增殖培养
12.将培养35-40天的芽丛转接种到增殖培养基中培养40-50天；
13.(4)生根培养
14.将步骤(3)中生长至3-5cm的小苗，倒插接种到ph为5.8的生根培养基中，培养8-12天开始生根，18-22天生根完成达到生根要求，出苗生根率为100％；
15.(5)组培苗移栽及管理
16.将步骤(4)生根的组培苗取出，清水冲洗干净，用提前泡发好的苔藓裹住根部，一定要裹实，移栽至花盆中，放置于加有保湿盖的育苗穴盘中，保持幼苗周围空气湿度在60％以上，温度25-30度，得到猪笼草盆钵苗。
17.优选地，消毒处理的具体方法为：先用75％的酒精表面消毒30秒，然后无菌水冲洗3次，再置于0.1％升汞溶液中10分钟，最后，无菌水冲洗5-6次。
18.优选地，所述接种培养基配方为：花宝一号1.6-3.2g+6-ba2.0mg/l+naa0.3mg/l+3％糖+7g琼脂；更优选地，所述接种培养基配方为：花宝一号1.6g+6-ba2.0mg/l+naa0.3mg/l+3％糖+7g琼脂。
19.优选地，所述增殖培养基的配方为：花宝一号2.0-3.6g+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+3％糖+7g琼脂；更优选地，所述增殖培养基的配方为：花宝一号2.0g+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+3％糖+7g琼脂。
20.优选地，所述生根培养基配方为：花宝一号1.2-2.8g+naa0.3mg/l+3％糖；更优选地，所述生根培养基配方为：花宝一号1.2g+naa0.3mg/l+3％糖。
21.以上培养基所选用的糖可以为蔗糖等培养基常用的糖。
22.优选地，所述接种培养基、增殖培养基和生根培养基的培养条件均为：光照强度为2000lx，温度23-25摄氏度，光照时间12小时。
23.本发明提供的一种猪笼草组织培养规模化生产方法，具有以下优点和效果：
24.(1)本发明根据猪笼草组织培养存在的问题，对培养基和培养条件进行了优化，采用了最佳的培养条件，利于其生根，成活。
25.(2)发明人在实验过程中发现，在生根培养阶段，正常放置的，生根时间长，一般2-3个月后才陆续开始生根，并且生根率为80％左右，一个偶然的机会发现，倒置的猪笼草(叶片朝下放入培养基，根部朝上)，生根时间更短，并且通过长期的实验结果发现，将种苗倒插接种在生根培养基上，其生根速度大大提高，培养10天左右就开始生根，并且结合使用不添加琼脂的液体培养基，生根速度快，生根率高，18-22天完成生根达到出苗要求，出苗生根率为100％，大大缩短了时间，可迅速提高种苗的生产效率。
26.(3)本发明方法简单易操作，可明显缩短培养时间，加快繁殖速度。具有生根率高、稳定性强、种苗整齐度好、抗性强等优势，应用前景广泛，适合大面积推广应用。
27.(4)本发明在工作台上无菌操作出苗，液体培养基可重复使用2次，减少了大量人力、物力、财力投入，节省大量的时间和成本，该方法对环境污染小，在保证生根和成苗的前提下，大大降低了生产成本，具有很好的推广价值。
附图说明
28.图1是采用液体培养基倒置生根情况；
29.图2是组培苗批量移栽后成活情况；
30.图3是采用固体培养基倒置生根情况；
31.图4是正常放置生根情况；
32.图5是正常放置底部观察生根情况；
33.图6是正常放置(左)、液体培养基倒置(中)、固体培养基倒置(右)生根情况对比。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。
35.若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。
36.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
37.实施例1一种猪笼草组织培养规模化生产方法，包括以下步骤：
38.(1)外植体的选择与消毒处理
39.选择生长健壮、无病虫害的猪笼草植株，用洗涤灵加水浸泡全株20分钟，然后，自来水冲洗15分钟，用消毒剪刀剪掉多余叶片取代芽茎段作为外植体；
40.将经过处理的猪笼草植株材料先用75％的酒精表面消毒30秒，然后无菌水冲洗3次，再置于0.1％升汞溶液中10分钟，最后，无菌水冲洗5-6次；
41.(2)诱导培养
42.将步骤(1)的外植体用无菌滤纸吸干水分，接种到花宝一号1.6g+6-ba2.0mg/l+naa0.3mg/l+3％糖+7g琼脂，ph为5.8的诱导培养基中，光照强度为2000lx，温度23-25摄氏度，光照时间12小时的培养条件下，培养7-8天外植体开始生长；
43.(3)增殖培养
44.将培养40天左右的芽丛转接种到花宝一号
45.2.0g+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+3％糖+7g琼脂，ph为5.8的增殖培养基中，在前述相同的培养条件下培养40-50天；
46.(4)生根培养
47.将步骤(3)中生长至3-5cm的小苗，接种到花宝一号1.2g+naa0.3mg/l+3％糖，ph为5.8的生根培养基中，在与前述相同培养条件下的小苗倒种在培养基上，培养10天左右生根(图1)，20天左右出苗生根率高达100％；
48.(5)组培苗移栽及管理
49.将步骤(4)生根的组培苗取出，清水冲洗干净，用提前泡发好的苔藓裹住根部，尽量一定要裹实，移栽至宽8cm、高7cm的花盆中，放置于加有保湿盖的育苗穴盘中，保持幼苗周围空气湿度在60％以上，温度25-30度，得到猪笼草盆钵苗(图2)，成活率可达98％。
50.实施例2一种猪笼草组织培养规模化生产方法，包括以下步骤：
51.(1)外植体的选择与消毒处理
52.选择生长健壮、无病虫害的猪笼草植株，用洗涤灵加水浸泡全株20分钟，然后，自来水冲洗15分钟，用消毒剪刀剪掉多余叶片取代芽茎段作为外植体；
53.将经过处理的猪笼草植株材料先用75％的酒精表面消毒30秒，然后无菌水冲洗3次，再置于0.1％升汞溶液中10分钟，最后，无菌水冲洗5-6次；
54.(2)诱导培养
55.将步骤(1)的外植体用无菌滤纸吸干水分，接种到花宝一号2.5g+6-ba2.0mg/l+naa0.3mg/l+3％糖+7g琼脂，ph为5.8的诱导培养基中，光照强度为2000lx，温度23-25摄氏度，光照时间12小时的培养条件下，培养7-8天外植体开始生长；
56.(3)增殖培养
57.将培养40天左右的芽丛转接种到花宝一号
58.2.8g+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+3％糖+7g琼脂，ph为5.8的增殖培养基中，在前述相同的培养条件下培养40-50天；
59.(4)生根培养
60.将步骤(3)中生长至3-5cm的小苗，接种到花宝一号2.0g+naa0.3mg/l+3％糖，ph为5.8的生根培养基中，在与前述相同培养条件下的小苗倒种在培养基上，培养10天左右开始生根；
61.(5)组培苗移栽及管理
62.将步骤(4)生根的组培苗取出，清水冲洗干净，用提前泡发好的苔藓裹住根部，尽量一定要裹实，移栽至宽8cm、高7cm的花盆中，放置于加有保湿盖的育苗穴盘中，保持幼苗周围空气湿度在60％以上，温度25-30度，得到猪笼草盆钵苗。
63.实施例3一种猪笼草组织培养规模化生产方法，包括以下步骤：
64.(1)外植体的选择与消毒处理
65.选择生长健壮、无病虫害的猪笼草植株，用洗涤灵加水浸泡全株20分钟，然后，自来水冲洗15分钟，用消毒剪刀剪掉多余叶片取代芽茎段作为外植体；
66.将经过处理的猪笼草植株材料先用75％的酒精表面消毒30秒，然后无菌水冲洗3次，再置于0.1％升汞溶液中10分钟，最后，无菌水冲洗6次；
67.(2)诱导培养
68.将步骤(1)的外植体用无菌滤纸吸干水分，接种到花宝一号3.2g+6-ba2.0mg/l+naa0.3mg/l+3％糖+7g琼脂，ph为5.8的诱导培养基中，光照强度为2000lx，温度23-25摄氏度，光照时间12小时的培养条件下，培养7-8天外植体开始生长；
69.(3)增殖培养
70.将培养40天左右的芽丛转接种到花宝一号
71.3.6g+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+3％糖+7g琼脂，ph为5.8的增殖培养基中，在前述相同的培养条件下培养40-50天；
72.(4)生根培养
73.将步骤(3)中生长至3-5cm的小苗，接种到花宝一号2.8g+naa0.3mg/l+3％糖，ph为5.8的生根培养基中，在与前述相同培养条件下的小苗倒种在培养基上，培养10天左右开始生根；
74.(5)组培苗移栽及管理
75.将步骤(4)生根的组培苗取出，清水冲洗干净，用提前泡发好的苔藓裹住根部，尽量一定要裹实，移栽至宽8cm、高7cm的花盆中，放置于加有保湿盖的育苗穴盘中，保持幼苗周围空气湿度在60％以上，温度25-30度，得到猪笼草盆钵苗。
76.对比例1
77.一种猪笼草组织培养规模化生产方法，包括以下步骤：
78.(1)外植体的选择与处理
79.选择生长健壮、无病虫害的猪笼草植株，用洗涤灵加水浸泡全株20分钟，然后，自来水冲洗15分钟，用消毒剪刀剪掉多余叶片取代芽茎段作为外植体；
80.将经过处理的猪笼草植株材料先用75％的酒精表面消毒30秒，然后无菌水冲洗3次，再置于0.1％升汞溶液中10分钟，最后，无菌水冲洗5-6次；
81.(2)诱导培养
82.将步骤(1)的外植体用无菌滤纸吸干水分，接种到花宝一号1.6-3.2g+6-ba2.0mg/l+naa0.3mg/l+3％糖+7g琼脂；ph为5.8的培养基中，光照强度为2000lx，温度23-25摄氏度，光照时间12小时的培养条件下，培养7天外植体开始生长；
83.(3)增殖培养
84.将培养40天左右的芽丛转接种到花宝一号
85.2.0-3.6g+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+3％糖+7g琼脂，ph为5.8的增殖培养基中，在前述相同的培养条件下培养40-50天；
86.(4)生根培养
87.在生根阶段，液体培养基换成固体培养基，也就是将实施例1中步骤(3)中生长至3-5cm的小苗，接种到花宝一号1.2-2.8g+naa0.3mg/l+3％糖”被“花宝一号1.2-2.8g+naa0.3mg/l+3％糖+7g琼脂”替代，这种情况下培养15天左右出根(图3)，25天左右能出苗生根率为95％。
88.对比例2
89.一种猪笼草组织培养规模化生产方法，包括以下步骤：
90.(1)外植体的选择与处理
91.选择生长健壮、无病虫害的猪笼草植株，用洗涤灵加水浸泡全株20分钟，然后，自来水冲洗15分钟，用消毒剪刀剪掉多余叶片取代芽茎段作为外植体；
92.将经过处理的猪笼草植株材料先用75％的酒精表面消毒30秒，然后无菌水冲洗3次，再置于0.1％升汞溶液中10分钟，最后，无菌水冲洗5-6次；
93.(2)诱导培养
94.将步骤(1)的外植体用无菌滤纸吸干水分，接种到花宝一号1.6-3.2g+6-ba2.0mg/l+naa0.3mg/l+3％糖+7g琼脂；ph为5.8的培养基中，光照强度为2000lx，温度23-25摄氏度，光照时间12小时的培养条件下，培养7天外植体开始生长；
95.(3)增殖培养
96.将培养40天左右的芽丛转接种到花宝一号
97.2.0-3.6g+6-ba1.5mg/l+naa0.1mg/l+3％糖+7g琼脂，ph为5.8的增殖培养基中，在前述相同的培养条件下培养40-50天；
98.(4)生根培养
99.在生根培养阶段，将步骤(3)中生长至3-5cm的小苗，接种到花宝一号1.2-2.8g+naa0.3mg/l+3％糖+7g琼脂，ph为5.8的生根培养基中，在与前述相同培养条件下的小苗正常放置在培养基上，结果发现前两个月没有生根(图4、图5)，2-3个月开始陆续生根，3个月后统计生根率为82％。
100.通过将本发明的方法和对比例1和2进行对比(图6)，可以发现，在生根阶段，采用不添加琼脂的液体培养基比固体培养基，生根时间短，生根率高。通过倒置培养和正常放置培养进行对比，可见猪笼草正常放置生根非常慢，大大制约了工厂化的生产，而倒置的方法，只需要10天左右就生根，和正常放置相比，大大缩短了时间，适合工厂化生产。
101.以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。