一种可广谱抑制水稻病原菌的碳纳米制剂及其制备方法和应用

1.本发明属于纳米材料技术领域和新型农药研发领域，涉及一种可有效广谱抑制水稻病原菌生长、防控水稻病害发生的保护性碳纳米制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.传统化学农药虽然也可有效防治病害发生，保护作物生产，但因其常具有高毒、高残留、对生态环境不友好等特性，目前已不能满足现代绿色农业的发展需要。随着当今人们对环境保护和食品安全的意识逐步增强，开发高效、低毒、环保的绿色生物农药已成为世界各国农业病害防控领域发展的主流趋势。
3.纳米技术的不断发展使得我们目前可以将各种原料物质纳米化，使之具有强于乃至完全不同于原料物质的物理、化学特性，这为发展新型绿色农药提供了新思路。至今，虽然已有不少纳米化的重金属离子杀菌剂的研发，然而随之造成的重金属离子在生态环境中的积累也已被报道。由此可见，开发绿色环保的纳米杀菌剂，原料物质的选取和创新是关键。利用生物源的无毒小分子有机物为原料，制备其纳米剂型的抑菌剂，是开发安全、环保新型生物农药的一个新思路。
4.水稻（oryza sativa）是我国乃至世界范围内最重要的粮食作物，水稻的稳产也是我国粮食安全的重要保障。由稻瘟病菌（magnaporthe oryzae）引起稻瘟病一直是危害水稻生产的最严重真菌病害。我国每年由稻瘟病直接造成的水稻产量损失高达30亿公斤，发病严重时可导致水稻减产40%-50%，甚至绝收。目前水稻生产上针对稻瘟病的防治常用的农药包括：三环唑、稻瘟灵、咪鲜胺、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、春雷霉素等，由其成分所决定，这些化学农药的过渡施用均会导致农业生态安全问题。近年来已有几种纳米材料被报道具有防治稻瘟病的效果，如纳米银、纳米硅、纳米几丁聚糖等。其中只有纳米银被证明具有直接抑制稻瘟病菌生长的作用，然而这种重金属纳米材料的应用安全性仍有待进一步测定。由水稻黄单胞菌（xanthomonas oryzae pv. oryzae）引起白叶枯病被广泛视为最严重影响水稻产量的细菌病害。白叶枯病菌主要从水稻伤口、气孔等部位侵染，生产上防治主要依赖于施用化学农药，如叶枯唑、噻菌铜悬浮剂等。由稻曲病菌（ustilaginoidea virens）引起的稻曲病是一种严重影响稻米品质的穗部病害，近年来在我国呈现大面积流行且逐年加重的趋势。由于抗病品种的缺乏和该病害发生的隐蔽性，使得目前水稻生产中针对稻曲病的发生缺乏行之有效的绿色防控技术。本发明研究成功创制了一种靶标稻瘟病菌微丝骨架肌动蛋白，进而有效抑制稻瘟病菌生长和对水稻侵染的碳纳米制剂，该碳纳米制剂可预防性防控稻瘟病的发生。此外，该碳纳米制剂对于水稻稻曲病菌、白叶枯病菌的生长同样具有较好的抑制作用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种可有效抑制水稻稻瘟病菌、稻曲病菌、白叶枯病菌生
长的碳纳米制剂及其制备方法，该碳纳米制剂可预防性防控稻瘟病的发生。
6.为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：一种可广谱抑制水稻病原菌的碳纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：1）取两根高纯石墨棒用超纯水超声清洗5min，超声功率300 w，超声频率40khz，后用吸水纸吸干表面水份；2）取1000ml质量分数为50%的植酸水溶液于烧杯中作为电解液，以清洗过的高纯石墨棒为阴极和阳极置于电解液中，两电极之间的距离保持在3~10cm，外加恒压直流电源15v~30v下持续电解25~30天，得到石墨烯的植酸分散液；3）将石墨烯的植酸分散液用中速定性滤纸过滤三次，而后采用离心机在22000 rcf条件下离心45 min，弃去沉淀，收集上清；4）将上清倒入截留分子量为500-1000d的透析袋中，在超纯水中透析24 h，即获得所述可有效广谱抑制水稻病原菌的碳纳米制剂。
7.一种利用上述的制备方法制得的碳纳米制剂。
8.上述一种碳纳米制剂在抑制水稻病原菌中的应用。
9.进一步的，上述抑制水稻病原菌为抑制水稻病原菌的菌丝生长和孢子萌发。
10.进一步的，上述水稻病原菌选自水稻稻瘟病菌、水稻稻曲病菌、水稻白叶枯病菌。
11.本发明具有以下有益效果：本发明可以简单快速的制备出含有高纯度和粒径均匀的纳米颗粒的碳纳米制剂，该碳纳米制剂可以有效抑制水稻稻瘟病菌、稻曲病菌、白叶枯病菌的生长，预防性地降低稻瘟病发生。
附图说明
12.图1为碳纳米制剂的透射电镜图、粒径分布图、红外图谱及拉曼光谱图。a，透射电镜图；b，粒径分布图；c，红外图谱；d，拉曼光谱图。
13.图2为碳纳米制剂的紫外吸收图。
14.图3为碳纳米制剂的的x射线光电子能谱图。
15.图4为碳纳米制剂和植酸对稻瘟病菌生长的抑制情况。
16.图5为碳纳米制剂和植酸处理稻瘟病菌15小时后的菌丝形态（标尺为20 μm）。
17.图6为碳纳米制剂对稻瘟菌分生孢子的影响。a，碳纳米制剂处理24小时后的稻瘟病菌孢子状态（标尺为50 μm）；b，碳纳米制剂处理24小时后稻瘟病菌分生孢子的萌发率。
18.图7为碳纳米制剂自发荧光与稻瘟病菌f-actin的共定位观察（标尺为20 μm）。
19.图8为稻瘟病菌接种前后12小时利用碳纳米制剂喷雾处理水稻叶片的最终发病情况。
20.图9为碳纳米制剂在pda培养基中对稻曲病菌生长的抑制情况。
21.图10为碳纳米制剂对白叶枯病菌生长的抑制情况统计。
22.具体实施方式：下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
23.本发明中所涉及到的实验材料如下：高纯石墨棒：石墨含量99%以上。
24.超纯水：电阻率为18.4mω
•
cm-1
。
25.植酸溶液：质量分数50%。
26.实施例1碳纳米制剂的制备步骤1：取两根高纯石墨棒用超纯水于25℃条件下超声清洗5min，超声功率300w，超声频率40khz，后用吸水纸吸干表面水份；步骤2：取1000ml质量分数为50%的植酸水溶液于烧杯中作为电解液，以清洗过的高纯石墨棒为阴极和阳极置于电解液中，两电极之间的距离保持在3~10cm，外加恒压直流电源30v下持续电解25~30天，得到石墨烯的植酸分散液；步骤3：将石墨烯的植酸分散液用中速定性滤纸过滤三次，而后采用离心机在22000rcf条件下离心45min，弃去沉淀，收集上清；步骤4：将上清倒入截留分子量为500-1000d的透析袋中，在超纯水中透析24h，即获得本发明所述可有效广谱抑制水稻病原菌的碳纳米制剂。
27.实施例2碳纳米制剂的表征参数实施例1制得的碳纳米制剂具有以下特征（图1~图3）：通过透射电镜表征可知，本发明制得的碳纳米制剂中纳米颗粒的粒径为2~5nm。通过拉曼光谱可知，该碳纳米制剂的拉面光谱图中存在两个峰，其分别对应的是碳纳米颗粒的d带（1334cm-1
）、g带（1601cm-1
）。如果在拉曼光谱中，d带的峰强度比g带的峰强度高，这说明碳纳米制剂有大量的缺陷存在，同时d带和g带的峰强度的比值（id/ig）可以衡量其无序程度。通过计算得出制备的碳纳米制剂的id/ig值为1.11，暗示了本发明的碳纳米制剂中存在无序的晶体结构。通过红外和x射线光电子能谱的测试可知，本发明的碳纳米制剂的表面具有含氧官能团，即-oh、-cooh、c-o-c、p-o、c-c。
28.实施例3碳纳米制剂对稻瘟病菌的抑制效果为了试验碳纳米制剂对稻瘟病菌菌丝生长的抑制效果，本发明在分别添加了75μg/ml、150μg/ml碳纳米制剂或植酸的sym培养基（每升sym培养基含10g可溶性淀粉、2g酵母提取物、3g蔗糖、20g琼脂粉，ph=6.5）上转接大小相同的稻瘟病菌guy11菌饼，在28℃下培养5天后计算生长抑制率，以未添加碳纳米制剂或植酸的sym培养基作为对照。结果发现（图4），碳纳米制剂处理相比于原物质植酸更能有效抑制稻瘟菌的菌丝生长，统计分析二者抑制率发现差异为极显著。
29.将培养好的大小相同的稻瘟病菌guy11菌饼分别置入含有75μg/ml的碳纳米制剂或植酸的cm液体培养基中，以未添加碳纳米制剂或植酸的cm液体培养基作为对照，用150rpm的转速28℃培养15小时后，通过显微镜观察可以发现碳纳米制剂处理的稻瘟菌菌丝细胞出现膨大、液泡化的现象（图5，白色箭头所指），而植酸处理的稻瘟病菌菌丝与对照相比没有明显差异。
30.将稻瘟病菌guy11接种至米糠培养基中（每升米糠培养基含40g米糠、20g琼脂粉，ph=6.5），从在培养了10天的米糠培养基上用0.02%的tween20洗下guy11的分生孢子，用双层滤纸过滤调整孢子浓度至5
×
104个/ml，并加入75μg/ml或150μg/ml的碳纳米制剂，并滴加在疏水玻片上，在22℃的保湿、黑暗条件下放置24小时后统计孢子萌发率。一个处理至少统计三次，每次100个以上分生孢子。**代表差异为极显著。由图6可见，碳纳米制剂对于稻瘟病菌分生孢子的萌发也具有显著的抑制作用。
31.实施例4碳纳米制剂抑制稻瘟病菌的靶标亚细胞结构使用含有75μg/ml碳纳米制剂的cm液体培养基在150转/分钟的摇床中培养携带f-actin标记红色荧光蛋白的稻瘟病菌株guy1112小时后，使用共聚焦显微镜观察。由于碳纳米制剂自发绿色荧光，如图7所示，我们可以观察到碳纳米制剂与f-actin的共定位。以上结果说明，碳纳米制剂可能靶标稻瘟病菌菌丝细胞内由丝状肌动蛋白组成的微丝骨架，破坏菌丝细胞的极性，进而达到抑制稻瘟病菌生长的效果。这一结果与图5中碳纳米制剂处理后引起菌丝细胞膨大、液泡化的现象吻合。
32.实施例5碳纳米制剂对水稻稻瘟病的防治效果为了进一步探究碳纳米制剂对于水稻稻瘟病的防治效果和使用方法，本发明在对水稻幼苗接种稻瘟菌guy11前和后12小时，利用150μg/ml的碳纳米制剂按0.5ml/株均匀喷洒处理水稻幼苗，6天后观察发病情况。如图8所示，稻瘟菌接种前利用碳纳米制剂处理，可以有效防控稻瘟病的发生；而接种后进行碳纳米制剂处理则对稻瘟病的防治没有明显效果。以上结果说明，150μg/ml的碳纳米制剂对水稻叶瘟具有较好的预防防治效果。
33.实施例6碳纳米制剂对水稻稻曲病菌的生长抑制效果本发明在pda固体培养基中测试了75μg/ml和150μg/ml的碳纳米制剂对稻曲菌株uv-fj-1生长的抑制作用，以未添加碳纳米制剂的pda固体培养基作为对照。如图9所示，28℃培养30天后，通过计算生长抑制率表明，与对照相比，碳纳米制剂对稻曲病菌的生长具有明显的抑制效果，且浓度越高抑制作用越强。
34.实施例7碳纳米制剂对白叶枯病菌的生长抑制效果本发明进一步试验了在naa固体培养基中碳纳米制剂对水稻白叶枯病菌的抑制效果。具体方法为：将白叶枯菌株px099在液体培养基（20g/l蔗糖+5g/l蛋白胨+0.5g/lfeso4.7h2o+0.5g/lca(no3).4h2o+2g/lna2hpo4，ph=6.8）上28℃培养至od
600
=0.4，然后取5μl分别滴加在含有75μg/ml和150μg/ml碳纳米制剂的naa固体培养基上。28℃培养两天后用1ml无菌水洗下细菌，而后每稀释10倍为一个梯度，共稀释10个梯度，滴加在naa固体培养基上，2天后统计可计数的菌落数，推算生长指数。如图10所示，75μg/ml和150μg/ml的碳纳米制剂对白叶枯病菌的生长均有显著抑制效果，且浓度越高抑制作用越强。不同小写之母代表彼此间差异为极显著。
35.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。