一种急性心肌病动物模型的构建方法

1.本发明属于生物医学领域，具体涉及一种接近临床实践或者临床肿瘤患者急性心肌病小鼠模型。


背景技术：

2.随着医疗技术的进步，全球癌症患者生存率显著提高。美国的癌症平均五年生存率是66％；国家癌症中心2022年数据显示我国过去10余年恶性肿瘤生存率呈逐渐上升趋势，目前我国恶性肿瘤的5年相对生存率约为40.5％。然而，在肿瘤幸存者中心血管疾病的发生率和死亡率仅次于肿瘤复发，乳腺癌患者10年后因心脏疾病所致死亡的风险已超过肿瘤本身；儿童肿瘤患者治疗后，其心脏死亡发生风险为正常人的8倍；青年肿瘤幸存者心血管发病风险增加了20倍。因此，如何降低肿瘤治疗伴随的心脏毒性是临床实践中亟待解决、备受关注的关键问题之一。
3.现行诸多肿瘤化疗方案中，阿霉素是最常用的化疗药物之一。在临床上广泛应用于各种恶性肿瘤的治疗。药物代谢动力学研究发现阿霉素细胞毒性主要与“血药浓度—时间”曲线下面积相关，但其急性心脏毒性主要与峰浓度相关。而由阿霉素毒性引起的心肌损伤，即阿霉素诱导的心肌病严重降低了患者的生活质量和幸存时间。对于阿霉素心肌病的发病机制及治疗策略是研究者关注的主要方向。然而已发表的文献对阿霉素心肌病模型构建的给药累积剂量、给药频次、建模周期各不相同，目前国际上尚未形成公认、统一、稳健的阿霉素心肌病动物模型构建方法。因此，构建合适的阿霉素急性心肌病动物模型为未来研究阿霉素心肌病发病机制及干预策略、提高动物福利、减少实验成本等提供理论支持是必要的。


技术实现要素：

4.目前已发表的文献对阿霉素心肌病模型构建的给药累积剂量、给药频次、建模周期各不相同，常规建模方法动物死亡率高、建模成功率低。目前国际上尚未形成公认、统一、稳健的阿霉素心肌病模型构建方法。为解决上述技术问题，本发明提供了一种建模成功率高，实验动物死亡率低的建模方法。
5.为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
6.本发明提供了一种急性心肌病动物模型的构建方法，分次、隔日给药方式获得急性心肌病动物模型，具体包括：
7.s1:选取雄性实验小鼠，使用普通饲料适应性喂养，随后评估基线心脏功能后，将心脏功能正常的小鼠随机分为对照组和给药组；
8.s2:让s1步骤的小鼠每天在23
±
2℃恒定温度和50-60％恒定湿度环境下自由进食、饮水；
9.s3:制备阿霉素溶液，通过分次、隔日给药方式对对照组小鼠和给药组小鼠进行注射给药；
10.s4:停药一周后，观察步骤s3中小鼠一般生命体征和体重变化；采用经胸小动物心脏超声技术评估左心室射血分数，获得动物模型。
11.优选地，所述给药方式为于构建模型开始的第一天和第三天分次进行阿霉素溶液注射；
12.优选地，所述注射的阿霉素溶液的浓度为0.25-1.0mg/ml，小鼠给药剂量按照7.5mg/kg体重计算；
13.更优选地，阿霉素溶液的浓度为0.5mg/ml；
14.优选地，所述小鼠为spf级c57bl/6j小鼠，小鼠周龄为8-10周龄，体重25g
±
3g。其中，c57bl/6系小鼠是一种常见的近交品系实验鼠。在遗传学试验中广泛用作转基因鼠以模拟人类的基因缺陷类疾病；
15.优选地，所述注射的方式为腹腔注射；
16.优选地，所述阿霉素溶液为使用97％及以上纯度的阿霉素制备的阿霉素溶液；
17.优选地，小鼠白日饲养周期为12小时；
18.所选动物可以为兔子等利于建模的物种。
19.其中，于建立模型之前，留存小鼠基线超声数据，用于作为心力衰竭评估的基线资料。通过经胸小动物心脏超声评估左心室射血分数是否符合心力衰竭标准，判断是否符合建模要求，符合则认为建模成功。通过心肌病理结果评价小鼠心肌损伤程度。
20.本发明还提供了根据所述的急性心肌病动物模型的构建方法构建的急性心肌病动物模型。
21.本发明还提供了根据所述的急性心肌病动物模型的构建方法构建的急性心肌病动物模型在抗肿瘤药物阿霉素引起的急性心肌病以及急性心力衰竭研究中的应用。
22.基于上述技术方案，本发明具体有以下有益效果：
23.1、采用分次、隔日给药的方式。在研究中发现单次大剂量给药会导致建模死亡率显著升高，而采用分次、隔日给药显著减少实验小鼠死亡率，提高建模成功率。因此本发明采用阿霉素7.5mg/kg分别于建模开始的第一天和第三天给药。
24.2、采用8-10周龄，体重25
±
3g小鼠。采用周龄和体重较大小鼠，提高实验小鼠的存活率。
25.3、采用腹腔注射给药。腹腔注射给药药物吸收缓慢，血药浓度峰浓度相对较低，这样给药安全性高、成模率高。腹腔注射给药其他优势还包括：一降低了给药难度；二尾静脉注射易造成鼠尾缺血坏死进而继发感染，而腹腔注射可避免此情况。
26.本发明提供了一种建模成功率高，实验小鼠死亡率低的急性心肌病动物模型的构建方法。
附图说明
27.图1为对照组和给药组小鼠胸骨旁左心室短轴切面m型超声图像和统计结果；
28.图2为各组对照组和给药组小鼠左心室组织he染色结果比较图。
具体实施方式
29.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。如为特殊说明，实施例
中所用技术均为本领域技术人员所熟知的常规技术。
30.本发明所用实验器械、材料、试剂等均可通过商业途径获取。本发明从北京维通利华实验动物技术有限公司购买40只c57bl/6j雄性小鼠，周龄为8-10周龄，体重范围为25g
±
3g。阿霉素为购于阿拉丁(d107159)。将20mg阿霉素粉末溶于40ml生理盐水中，应用超声震荡仪进行充分溶解混匀，即制备阿霉素溶液浓度为0.5mg/ml备用。同理，也可制备其他浓度的阿霉素溶液，阿霉素溶液的浓度为0.25-1.0mg/ml。
31.实验动物分别编号并随机分组，分为对照组(con)、给药组1(m1)、给药组2(m2)、给药组3(m3)。所有给药组动物均于最后一次给药1周后处死。分别从小鼠一般生命体征、体重变化和存活率、心脏超声、体表心电图、心肌组织形态改变等方面综合评估建模效果。
32.本发明实验已获得天津医科大学伦理委员会批准同意。
33.以下为本发明实施例所用材料和具体方法：
34.实施例1小鼠急性心肌病建模具体实验过程
35.将实验动物每天在23
±
2℃恒定温度和50-60％恒定湿度环境下自由进食、饮水，适应性喂养1周后，其中小鼠白日饲养周期为12小时。将实验动物分别编号并随机分组，分为对照组(con)、给药组1(m1)、给药组2(m2)、给药组3(m3)，并按照表1给予注射不同方式的阿霉素溶液。
36.表1实验小鼠阿霉素给药方式
37.编号给药种类及剂量给药方式对照组(con)生理盐水，总剂量＝15mg/kg连续3天给药组1(m1)单次给药15mg/kg i.p.，总剂量＝15mg/kg一次性给药给药组2(m2)单次5mg/kg i.p.，总剂量＝15mg/kg连续3天给药给药组3(m3)单次7.5mg/kg i.p.,总剂量＝15mg/kg隔日给药,共2次
38.对照组连续3天给予生理盐水腹腔注射；给药组1(m1)给予单剂量15mg/kg腹腔注射、给药组2(m2)给予单次剂量5mg/kg，连续3天腹腔注射、给药组3(m3)给予单次剂量7.5mg/kg，隔日腹腔注射。
39.观察小鼠的精神状态、进食情况、毛发、日常活动情况、排便情况，同时记录各组小鼠存活情况。
40.表2小鼠死亡率比较数据
[0041][0042][0043]
在给药组3中，其存活率达到80％以上，给药组1和给药组2的小鼠存活率分别为
fraction)；缩短分数(fractional shortening)；左心室质量(lv mass)等。
[0059]
四腔心切面可获得的心脏超声参数：舒张早期血流充盈速度峰值(mv e)、心房收缩期血流速度峰值(me a)、二尖瓣舒张早期运动速度(mv e’)等。
[0060]
各组小鼠超声心动图结果如图1所示，a：各组小鼠胸骨旁左心室短轴切面m型超声图像；b-c：统计结果；*，p《0.05；**，p《0.01；***，p《0.001；****，p《0.0001。数据表示为均数
±
标准差。
[0061]
表3对照组与给药组心脏超声参数比较
[0062]
分组左心室射血分数lvef(％)左心室短轴缩短率lvfs(％)对照组(con)54.72
±
1.64％27.8
±
1.05％给药组1(m1)46.00
±
4.41％22.57
±
2.5％给药组2(m2)54.68
±
3.38％27.86
±
2.2％给药组3(m3)40.40
±
2.24％19.40
±
1.2％
[0063]
相较于对照组、给药组1、给药组2，给药组3左心室射血分数显著下降。
[0064]
此外，与对照组、给药组1、给药组2，给药组3左心室短轴缩短率显著下降。
[0065]
此外，胸骨旁左心室长轴和短轴切面显示ivs、lvpw、lvid在收缩和舒张期均无显著差异。
[0066]
实施例3心脏病理学形态检查
[0067]
通过he染色实验观察小鼠心脏病理学的形态。其中具体染色过程为：
[0068]
依次将石蜡切片浸入二甲苯i，10分钟；二甲苯ii，10分钟；无水乙醇i，1分钟；无水乙醇ii，1分钟；95％乙醇i，1分钟；90％乙醇，1分钟；85％乙醇，1分钟；蒸馏水冲洗2分钟，然后将苏木素染液滴于组织上，室温孵育5分钟，自来水洗1分钟；
[0069]
分化：1％盐酸酒精分化20s，自来水冲洗1分钟；
[0070]
返蓝：1％氨水返蓝30s，自来水冲洗1分钟；
[0071]
将伊红染液滴于切片组织上，室温孵育2分钟，自来水涮洗30s；
[0072]
梯度脱水及透明：将切片依次浸入85％乙醇，20s；90％乙醇，30s；95％乙醇i，60s；95％乙醇ii，60s；无水乙醇i，2分钟；无水乙醇ii，2分钟；二甲苯i，2分钟；二甲苯ii，2分钟。
[0073]
封片：切片从二甲苯中拿出稍晾干，中性树胶封片，显微镜下观察，拍照并分析。
[0074]
结果分析：本发明中心肌组织he染色如图2所示。与con相比，给药组心肌均可见心肌细胞空泡化变性，细胞径向增大，部分肌纤维走向紊乱；其中m3心肌细胞空泡化程度及数量(81个/视野vs 3个/视野、65个/视野、34个/视野，p《0.05)显著高于其他实验组，细胞径向增大最明显。与m1相比，m2、m3中dox所致的心肌细胞空泡化数量减少，心肌细胞纤维排列紊乱较轻。
[0075]
阿霉素急性心肌病动物模型的构建的目的是为了研究阿霉素心脏毒性的发病机制，评断药物治疗的效果等，为了一个公认、直观、可视化的评价模型建立成功与否的标准，本发明通过超声评价小鼠左心室射血分数，同时结合各组小鼠存活率来综合评估。
[0076]
在给药组3中，其存活率达到80％以上，且其左心室射血分数均值为40.40％，较对照组的54.72％呈显著下降，且两组射血分数有统计学差异。说明本发明建立阿霉素急性心肌病模型的方法是有效的，同时具有建模成功率高，实验动物死亡率低的有益效果。
[0077]
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但是在
本发明创造的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的研究人员在不偏离本发明精神及其技术方案和发明构思等基础上所做的修改及改进，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。