一种基于小檗碱衍生物的光敏杀菌剂的制作方法

1.本技术涉及抗菌技术领域，尤其是涉及一种基于小檗碱衍生物的光敏杀菌剂。


背景技术：

2.自超级细菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌被发现以来，抗生素的耐药性问题成为了临床上的主要问题之一。金黄色葡萄球菌具有多种耐药机制，解决抗生素耐药性的方法主要是使用新抗生素，但新抗生素开发的速度远远小于耐药性产生的速度。因此，开发一种替代抗生素的具有抗耐药能力的抗菌方法是必要的。抗菌光动力疗法是一种利用光和光敏剂在有氧环境中抗菌的方法，其原理在于，当光子的能量被光敏剂吸收、并被转移到周围的分子上时，会形成活性氧和自由基，破坏参与细菌生长增殖的小分子，如蛋白质、脂质和核酸，导致细菌死亡。而且，与抗生素不同的是，光动力疗法同样能够对抗耐药突变的病原菌。因此，许多研究人员对抗菌光动力疗法进行了深入研究。
3.合成光敏剂亚甲基蓝和甲苯胺蓝是两种在抗菌光动力疗法中最常用的光敏剂，天然光敏剂(姜黄素和金丝桃素)、四吡咯类酞菁结构化合物和卟啉类化合物也是研究比较多的光敏剂。光敏剂必须选择性地靶向病原体，不能对人体组织造成伤害，并且具有良好的亲水性，以达到更高的利用率，而这仍然是目前光敏剂开发的难点。许多光敏剂存在一定的毒性、致癌性、不可生物降解，会对人体健康造成严重威胁并对环境造成影响。临床光敏剂亚甲基蓝是较安全的光敏剂，但也有报道其对神经组织有毒，硬膜外注射可能导致截瘫，并且可能对新生儿造成溶血性贫血、呼吸窘迫和光毒性。因此，开发安全且高效的光敏剂是十分必要的。


技术实现要素：

4.本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种基于小檗碱衍生物的光敏杀菌剂。该光敏杀菌剂对于哺乳动物细胞具有良好的安全性，并且在经光照后能够有效杀伤细菌。
5.本技术的第一方面，提供一种小檗碱衍生物在制备光敏剂中的应用，所述小檗碱衍生物具有如下结构式：
[0006][0007]
其中，x为卤素。
[0008]
根据本技术实施例的应用，至少具有如下有益效果：
[0009]
该小檗碱衍生物对于哺乳动物细胞具有良好的安全性，并且在经光照后能够有效杀伤细菌，因此可以作为安全高效的光敏剂使用。
[0010]
在本技术的一些实施方式中，x选自氟、氯、溴、碘中的至少一种。
[0011]
在本技术的一些实施方式中，x选自氯、溴中的至少一种。
[0012]
本技术的第二方面，提供一种小檗碱衍生物在制备光敏杀菌产品中的应用，所述化合物具有如下结构式：
[0013][0014]
其中，x为卤素。
[0015]
在本技术的一些实施方式中，x选自氯、溴中的至少一种。
[0016]
在本技术的一些实施方式中，所述光敏杀菌产品用于杀灭革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌中的至少一种。
[0017]
其中，革兰氏阳性菌选自葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属的细菌，例如金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)等；革兰氏阴性菌选自不动杆菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、弧菌属的细菌，例如鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、大肠埃希菌(escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)、沙门氏菌(salmonella enteriditis)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(vibrio parahemolyticus)。
[0018]
在本技术的一些实施方式中，所述光敏杀菌产品用于杀灭金黄色葡萄球菌、大肠杆菌中的至少一种。其中，金黄色葡萄球菌包括敏感型金黄色葡萄球菌和耐药金黄色葡萄球菌，敏感型金黄色葡萄球菌可以是甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌mssa，耐药金黄色葡萄球菌可以是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa，其它也可以是对氨苄霉素、核霉素、头孢氨苄、头孢来星、头孢菌素ii、头孢菌素、氯霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、新生霉素、四环素、苯唑西林等抗生素敏感或耐药的金黄色葡萄球菌等，具体可以是atcc 25923、atcc 29213、atcc 43300、atcc 700699等。大肠杆菌包括肠黏附性大肠杆菌(eaec)、肠出血性大肠杆菌(ehec)、肠侵袭性大肠杆菌(eiec)、肠致病性大肠杆菌(epec)、产肠毒素性大肠杆菌(etec)等。
[0019]
本技术的第三方面，提供一种物质的杀菌方法，该杀菌方法包括以下步骤：
[0020]
将所述物质与光敏剂接触，光照；
[0021]
其中，所述光敏剂包括具有如下结构式的小檗碱衍生物：
x为卤素。
[0022]
在本技术的一些实施方式中，所述光照为使用包含波长在400～450nm内的光进行照射。
[0023]
在本技术的一些实施方式中，每单位面积光照的能量为0.015mwh/cm2以上。在本技术的一些实施方式中，光照强度为0.1mw/cm2以上。进一步的，光照强度在0.2mw/cm2以上、0.5mw/cm2以上、1mw/cm2以上、2mw/cm2以上、5mw/cm2以上、10mw/cm2以上。
[0024]
在本技术的一些实施方式中，光照时间为10s以上。进一步的，光照时间在15s以上、20s以上、30s以上、45s以上、1min以上、2min以上、5min以上、10min以上、20min以上。
[0025]
在本技术的一些实施方式中，光照强度为0.1mw/cm2以上，光照时间为10s以上。
[0026]
在本技术的一些实施方式中，每单位面积光照的能量为0.015mwh/cm2以上，光照强度为0.1mw/cm2以上，光照时间为10s以上。
[0027]
在本技术的一些实施方式中，光照强度为0.1mw/cm2以上，光照时间为10min以上。
[0028]
在本技术的一些实施方式中，光敏剂以小檗碱衍生物至少为10μg/ml的浓度与物质接触。进一步的，以化合物的浓度至少为20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml与物质接触。
[0029]
通常而言，光敏剂的浓度越高、光照强度越强、光照时间越强，则杀菌的效果就越好。
[0030]
在本技术的一些实施方式中，光敏剂以小檗碱衍生物至少为50μg/ml的浓度与物质接触，光照强度为0.1mw/cm2以上，光照时间为10min以上。
[0031]
在本技术的一些实施方式中，物质的杀菌方法为非治疗目的的杀菌，具体而言，物质不为有生命的人体或动物体，或者该杀菌方法并不直接以阻断、缓解或者消除病因活病灶为目的。例如可以是对环境(如墙壁、地板、水体等)进行杀菌，或者以离体并且在杀菌后不会返回人体或动物体的细胞、组织、器官作为所述物质进行杀菌的方法。
[0032]
本技术的第四方面，提供一种杀菌装置，该杀菌装置包括：
[0033]
光源，光源用于向设定区域发出光；
[0034]
光敏剂供给部，光敏剂供给部存储有光敏剂并能够将光敏剂施加到设定区域，光敏剂包括具有如下结构式的小檗碱衍生物：x为卤素。
[0035]
在本技术的一些实施方式中，光源可以向设定区域发出波长在400～450nm的光。
[0036]
在本技术的一些实施方式中，光敏剂供给部能够将光敏剂以溶液形式施加到设定区域，从而可以使光敏剂与设定区域内可能存在的细菌实现更好的接触。进一步，光敏剂供
给部能够将光敏剂以雾化的溶液形式施加到设定区域。
[0037]
在本技术的一些实施方式中，设定区域可以是杀菌装置内部的区域，例如将待杀菌的物质送入杀菌装置的内部进行杀菌；也可以是杀菌装置外部的区域，例如直接以杀菌装置对位于外部的待杀菌的物质进行杀菌。
[0038]
本技术的第五方面，提供一种光敏杀菌剂，该光敏杀菌剂包括具有如下结构式的小檗碱衍生物：x为卤素。
[0039]
在其中一些实施方式中，光敏杀菌剂为上述小檗碱衍生物。
[0040]
在其中一些实施方式中，光敏杀菌剂包括载体和负载在载体上的小檗碱衍生物。
[0041]
在其中一些实施方式中，载体为靶向递送载体，利用该载体可以将小檗碱衍生物靶向递送到需要杀灭目标菌的部位，例如该载体包括能够特异性识别目标菌的靶向肽、抗体或抗原结合片段、核酸适配体等。在将光敏杀菌剂靶向递送到目标菌的部位后，启动光照实现高效率的光敏杀菌。
[0042]
本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
附图说明
[0043]
图1是本技术的实施例中不同光敏剂对哺乳动物细胞的增殖抑制率，其中(a)为小鼠胚胎成纤维细胞与不同浓度的b125接触对于细胞增殖率的影响，(b)为正常人肠上皮贴壁细胞与不同浓度的b125接触对于细胞增殖率的影响。
[0044]
图2是本技术的实施例中不同光照时间对杀菌能力的结果。其中，b125的浓度为50μg/ml，光照强度为0.2mw/cm2，波长405nm；**，p《0.01；实验菌株为金黄色葡萄球菌atcc 25923。
[0045]
图3是本技术的实施例中不同光敏剂对不同参考菌株的杀菌能力的结果。其中，各种光敏剂的浓度均为50μg/ml，光照强度为1mw/cm2，波长405nm，光照时间20min；**，p《0.01。
具体实施方式
[0046]
以下将结合实施例对本技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本技术保护的范围。
[0047]
下面详细描述本技术的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
[0048]
在本技术的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只
是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。在以下描述中，虽然在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于流程图中的顺序执行所示出或描述的步骤。
[0049]
除非另有定义，本技术中所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述本技术实施例的目的，不是旨在限制本技术。
[0050]
本技术的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0051]
下面结合具体实例进行说明。
[0052]
实施例1
[0053]
本实施例提供一种化合物b125，其结构式如下：
[0054][0055]
该化合物的合成路线如下：
[0056][0057]
具体步骤为：
[0058]
0℃下，在3-甲氧基苯乙酸(化合物1，1.66g，10.0mmol)的thf溶中加入硼烷thf络合物溶液(20.0ml，20.0mmol)。将混合物加热至室温并搅拌2小时，然后用1m氢氧化钠水溶液进行淬火，使用乙醚提取所得混合物，用饱和盐水清洗结合的有机层，mgso4干燥后真空浓缩。随后在二氯甲烷(dcm，50ml)中将浓缩产物重新溶解并冷却至0℃，向混合物中依次添加吡啶(pyr，0.8ml，20.0mmol)和新戊酰氯(pivcl，2.78ml，20.0mmol)，加热至室温并搅拌18小时，h2o(5ml)淬火，ch2cl2萃取。饱和盐水清洗结合的有机层，mgso4干燥后真空浓缩。通
过快速色谱法(pe/etoac＝20：1)纯化残余物，得到3-甲氧基苯乙基新戊酸酯(化合物2，2.12g，90％)。
[0059]
0℃下，在化合物2(1.89g，8.0mmol)的醋酸酐(ac2o，20ml)溶液中添加zncl2(5.45g，40.0mmol)。将混合物置于室温搅拌18小时后，真空浓缩，然后在乙酸乙酯中重新溶解。饱和盐水清洗混合物，有机相在mgso4干燥后真空浓缩。通过快速色谱法(pe/etoac＝10：1)纯化残余物，得到2-乙酰-5-甲氧基苯乙基新戊酸酯(化合物3，1.66g，75％)。
[0060]
向2-溴-6-甲氧基苯甲醛(化合物4，2.15g，10mmol)和乙二醇(eg，2.78ml，50mmol)的甲苯(eb，200ml)溶液中依次添加原甲酸三乙酯(hc(oet)3，5.0ml，30.0mmol)以及对甲基苯磺酸(ptsa，190mg，1.0mmol)。90℃保温18h，然后冷却至室温并用乙醚萃取。饱和盐水清洗结合层，mgso4干燥后真空浓缩。通过快速色谱法(pe/etoac＝10：1)纯化残余物，得到2-(2-溴-6-甲氧基苯基)-1,3-二恶戊烷(化合物5，2.56g，99％)。
[0061]
向化合物5(596mg，2.3mmol)和化合物3(1.28g，4.6mmol)的thf(30ml)溶液中添加cs2co3(1.87g，5.75mmol)以及(amphos)2pdcl2(81mg，0.115mmol)。用氩气将所得溶液鼓泡至少10分钟，然后迅速配备特氟隆隔膜。将混合物在90℃下加热18h。然后将混合物冷却至室温并用水淬火并用乙醚萃取，用饱和盐水清洗的组合有机层，mgso4干燥并在真空中浓缩。通过快速色谱法(pe/etoac＝4：1)纯化残余物，得到2-(2-(1-(1,3-二氧杂环-2-基)-3-甲氧苯基)乙酰基)-5-甲氧基苯乙基新戊酸酯(化合物6，756mg，72％)。
[0062]
将化合物6(723mg，1.58mmol)与1m nh4cl的溶液(etoh/h2o摩尔比为3：1，4ml)混合，氩气鼓泡10分钟以上，将搅拌好的混合物在90℃下加热18h得到化合物7，然后在110℃下继续加热48h，随后冷却至室温，真空浓缩。通过快速色谱法纯化残留物(ch2cl2/meoh＝10：1)得到粗产物。粗产物在甲醇/乙醚中重结晶，得到浅黄色固体3,9-二甲氧基-5,6-二氢异喹啉[3,2-a]异喹啉-7-氯化铵(化合物8，368mg，71％)。
[0063]
该小檗碱衍生物命名为b125，水溶液在400nm有最大吸收峰，采用405nm光激发后能够发出荧光，荧光最大波长为510nm。
[0064]
实施例2：安全性实验
[0065]
采用mtt法检测b125对哺乳动物细胞的安全性。将小鼠胚胎成纤维细胞以及正常人肠上皮贴壁细胞分别以1
×
104个/孔的密度接种在96孔板中。37℃孵育过夜后，用不同浓度的b125处理细胞15小时，然后向每个孔中加入20μl mtt(5mg/ml)溶液，并在37℃下孵育4小时，然后小心地取出培养基。向每个孔中加入150μl dmso。使用微板读取器测量570nm处的吸光度。
[0066]
结果如图1所示，从图中可以看出，对于这两种细胞而言，随着b125浓度的上升，增殖率的下降并不明显，其中，b125在50μg/ml时对小鼠胚胎成纤维细胞和人正常肠上皮细胞的增殖均没有明显的抑制作用。上述结果表明，b125具有良好的安全性，作为光敏剂使用时不会对人体健康造成大的影响。
[0067]
实施例3：b125杀菌的对比实验
[0068]
配制1mg/ml的b125水溶液，向190μl含有108cfu/ml金黄色葡萄球菌的pbs中加入10μl b125溶液，室温孵育5min，使用405nm led灯，在0.2mw/cm2光照强度下照射不同时间，设置不添加b125以及不进行光照的两组对照，比较杀菌效率。
[0069]
用平板计数法测定细菌活力，将处理后的细菌溶液10倍梯度稀释至108倍，将各倍
数稀释液进行涂板，37℃培养18h后进行拍照计数。
[0070]
实验结果如图2所示，相比于不使用光敏剂，单独使用b125而不进行光照后10～30min内菌落数量的变化并无显著性，表明b125并不能够单独起到杀菌作用；而在使用b125结合光照后20～30min，菌落数量相比于无光敏剂的对照有了明显变化，表明b125可以作为光敏剂通过光照激活光化学反应或光物理反应，使得其中的活性氧、自由基等数量激增，起到杀菌作用，并且随着光照时间的增加，杀菌能力也变得更强。
[0071]
实施例4：不同光敏剂杀菌的对比实验
[0072]
配制1mg/ml的b125水溶液，向190μl含有108cfu/ml金黄色葡萄球菌的pbs中加入10μl b125溶液，室温孵育5min，使用405nm led灯，在1mw/cm2光照强度下照射20min，使用参考光敏剂小檗碱(bbr)、亚甲基蓝(mb)、二氢卟吩e6(ce6)以及未光照的b125作为对照，比较杀菌效率。
[0073]
用平板计数法测定细菌活力，将处理后的细菌溶液10倍梯度稀释至108倍，将各倍数稀释液进行涂板，37℃培养18h后进行拍照计数。
[0074]
按照上述类似的方法，取不同浓度的b125溶液与上述细菌共孵育，在无光照条件下测量其最小抑菌浓度(抑制病原菌生长繁殖的药物的最低浓度)，结果分别为70μg/ml(金黄色葡萄球菌atcc 25923)、50μg/ml(金黄色葡萄球菌atcc 29213)、110μg/ml(金黄色葡萄球菌atcc 43300)、30μg/ml(金黄色葡萄球菌atcc 700699)、300μg/ml(大肠杆菌ehec)、250μg/ml(大肠杆菌epec)。
[0075]
在光照条件下，实验结果如图3所示，小檗碱衍生物b125对敏感型金黄色葡萄球菌atcc 25923、atcc 29213和耐药金黄色葡萄球菌atcc 43300、atcc 700699以及致病性大肠杆菌epec均具有良好的杀灭效果。并且，b125的光动力杀菌活性显著强于目前临床上使用的光敏剂亚甲基蓝以及与b125具有类似骨架结构的bbr。
[0076]
因此，b125具有强光动力杀菌活性，在可见光照射后能够杀死99％以上耐药金黄色葡萄球菌，能够应用到相应的使用场景下进行杀菌消毒。
[0077]
实施例5
[0078]
本实施例提供一种杀菌装置，该杀菌装置包括光源以及光敏剂供给部，光敏剂供给部包括存储组件和喷雾组件，存储组件中存储有b125干粉，并能够在注入无菌水后得到b125的溶液，或者直接存储有b125的无菌水溶液；喷雾组件与存储组件相连。
[0079]
本实施例还涉及利用该杀菌装置进行杀菌的方法，包括以下步骤：
[0080]
将b125的溶液由存储组件导入到喷雾组件，向物质表面施加b125溶液的喷雾。同时打开光源，向物质表面发出405nm的光，使喷雾中的b125在光照下发生光化学反应或光物理反应，生成自由基、活性氧，从而对物质表面存在的细菌的内部组织、细胞膜等造成破坏，起到杀菌的作用。
[0081]
实施例6
[0082]
本实施例提供一种光敏杀菌产品，其中包含光敏剂，该光敏剂的结构式为：
[0083][0084]
上面结合实施例对本技术作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。