Ift140基因视杆细胞条件敲除小鼠模型的构建方法及应用

ift140基因视杆细胞条件敲除小鼠模型的构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及医学工程技术领域，具体而言，涉及ift140基因视杆细胞条件敲除小鼠模型的构建方法及应用。


背景技术：

2.遗传性视网膜变性(inherited retinal degeneration,ird)，是一大类由不同基因缺陷导致视网膜受损的疾病，具有高临床异质性，患者发病年龄与视力障碍的严重程度等差异显著，目前尚无有效治疗方法，是不可逆致盲性眼病的最主要原因，是亟待攻克的科学难题和重大公共卫生问题。ird可单独发生，也可与其他器官的表现共同存在，构成多种临床综合征。ird具有高遗传异质性，遗传方式主要有常染色体隐性、显性与x性连锁隐性三种，其中以常染色体隐性遗传最多。根据目前的报道，ird的致病基因多达数百个。
3.纤毛内转运蛋白(intraflagellar transport,ift)140是细胞内纤毛转运蛋白家族的成员。真核细胞的纤毛和鞭毛，包括原纤毛和运动纤毛，几乎分布在所有细胞的表面，是很保守的细胞结构。它具有双向转运功能，拥有一套特殊的装置，包括ift运动蛋白，ift转运单位以及被转运的分子。ift转运单位包括正向转运的复合体a和逆向转运的复合体b，其中ift140属于复合体a。
4.ift140基因变异导致综合征性和非综合征性ird。ird表型包括leber先天性黑矇(leber congenital amaurosis,lca)、早发严重视网膜变性(early onset severe retinal dystrophy,eosrd)和常染色体隐性遗传视网膜色素变性(autosomal recessive retinitis pigmentosa,arrp)。lca/eosrd患者出生或幼年时即有严重的视力障碍，rp患者自青少年或成年起病，逐渐进展直至全盲，严重影响患者的生活质量，给患者家庭及社会造成沉重负担。2015年申请人课题组首次报道ift140变异导致非综合征性ird，随后多篇报道进一步证实ift140是ird的致病基因之一。但是目前针对ift140相关ird的机制研究仅有1篇，且该研究采用视锥细胞特异性ift140条件敲除模型鼠，不能很好的模拟ift140在感光细胞中的作用(已知小鼠视网膜感光细胞中大部分为视杆细胞，视锥细胞仅占3％)；未对模型鼠的临床表型和自然病程进行鉴定和描述；也未对模型鼠中其他ift蛋白和视网膜特异性纤毛蛋白的位置和表达进行研究，对ift140变异导致ird的机制探讨并不全面细致。因此，为了更好的研究ift140蛋白在视网膜中的功能，需要构建一种更好的疾病模型。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种ift140基因视杆细胞条件敲除小鼠模型的构建方法及其应用。
7.为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
8.一种ift140基因视杆细胞条件敲除小鼠模型的构建方法，其包括：敲除小鼠视网膜视杆细胞基因组中的ift140基因。
9.ift140是ift-a的核心组分之一。ift-a由6种蛋白组成，ift-b由16种蛋白组成，分别介导纤毛内逆向和正向。视网膜感光细胞外节是特化的纤毛结构，膜盘更新速度快，因此对于纤毛内转运速率要求更高。发明人推测ift140基因变异可能改变ift蛋白网络的表达和分布，影响内外节物质转运，造成感光细胞进行性死亡。基于此，发明人构建了ift140基因视杆细胞条件敲除小鼠模型，在小鼠的视网膜视杆细胞中敲除ift140基因即沉默其在视杆细胞中表达，验证得到条件敲除视杆细胞ift140基因，可以使得小鼠表现出视网膜变性疾病相关的特征，例如视网膜明显变薄，色素异常，外层明显萎缩，视锥视杆功能均严重降低，视网膜外层感光细胞萎缩等。因此，视网膜视杆细胞中的ift140基因被敲除的小鼠可以作为视网膜变性疾病模型，并用于视网膜变性病变疾病研究等领域中，为该疾病的研究例如发病过程、机制以及相关药物的筛选提供一种新的模型。
10.在本发明应用较佳的实施方式中，上述敲除小鼠视网膜视杆细胞基因组中的ift140基因是指敲除小鼠视网膜视杆细胞基因组中的ift140基因的外显子序列。
11.敲除ift140基因序列可以是敲除ift140基因全长序列，敲除ift140基因的外显子序列，也可以是敲除ift140基因部分序列例如部分外显子序列，无论敲除那种类型(部分或全长)的序列，只要是能够在视杆细胞中沉默ift140基因的表达，使动物表现出视网膜变性类疾病相应特征即落入本发明的保护范围。
12.在本发明应用较佳的实施方式中，上述敲除目标动物视网膜视杆细胞基因组中的ift140基因的第7号外显子序列。
13.在本发明应用较佳的实施方式中，上述构建方法包括：采用cre-loxp敲除技术敲除小鼠视网膜视杆细胞基因组中的ift140基因敲除小鼠视网膜视杆细胞基因组中的ift140基因。
14.在其他实施方式中，也可以是sirna介导的基因沉默技术。此外，采用其他手段实现ift140基因的敲除也属于本发明的保护范围。
15.在本发明应用较佳的实施方式中，上述目标动物为小鼠，但是并不限于小鼠，还可以是大鼠、狗、猪、猴、兔、牛、马、羊和猿中的任意一种。
16.无论选用何种动物，只要是具有ift140基因的动物，均可作为本发明所述构建方法中的目标动物，在其视杆细胞中敲除ift140基因，使其表现出视网膜变性类疾病特征，作为视网膜变性疾病模型，用于视网膜变性类疾病研究领域中，均属于本发明的保护范围。
17.在本发明应用较佳的实施方式中，上述构建方法是采用cre-loxp敲除技术敲除小鼠视网膜视杆细胞基因组中的ift140基因，其包括：将neo阳性嵌合鼠与flp鼠交配繁殖，获得ift140-loxp杂合子小鼠，然后将ift140-loxp杂合子小鼠进行相互交配，得到ift140-loxp纯合子小鼠，将ift140-loxp纯合子雄鼠与rho-icre杂合子雌鼠交配，得到视网膜视杆细胞ift140条件性敲除基因小鼠。
18.在本发明应用较佳的实施方式中，嵌合鼠的构建方法为：将靶向ift140基因es细胞系注射至野生型小鼠囊胚腔，注射后的囊胚移植到假孕小鼠子宫内，发育成熟后获得嵌合小鼠。
19.靶向ift140基因es细胞系为komp来源(www.komp.org)的es细胞系epd0073_5_f01(基因型为ift140
neo
)，flp鼠为c57bi/6flp1小鼠(生殖细胞表达flpe)。
20.在本发明应用较佳的实施方式中，上述条件性敲除ift140基因的首建小鼠的
ift140基因带有loxp位点。
21.在本发明应用较佳的实施方式中，将嵌合小鼠与flp鼠交配繁殖后，进行基因型鉴定，筛选获得ift140-loxp的杂合子小鼠。
22.rho-icre杂合子小鼠是从赛业公司购买的视杆细胞特异表达cre酶的小鼠。将纯合子小鼠与rho-icre基因小鼠交配得到视网膜视杆细胞ift140条件性敲除基因小鼠。改造的cre蛋白可以进入视杆细胞的细胞核，识别基因组上loxp位点，实现ift140基因的条件性敲除。rho为视杆细胞特异表达基因，在rho基因启动子后插入cre序列可以介导cre酶在该细胞中特异性表达。
23.由上述构建方法所构建出的视杆细胞条件敲除ift140基因小鼠模型在筛选用于预防或治疗视网膜变性疾病药物中的应用。
24.本发明的构建方法得到的小鼠模型具有视网膜变性病变特征，具有非常广阔的应用前景，例如将其用于研究视网膜变性疾病的发病过程、发病机制，为深入了解研究该类疾病提供基础。又或者将其用于筛选用于预防或治疗视网膜变性类疾病药物、用于评价药物的疗效或预后等。
25.在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用包括早发严重性视网膜变性。
26.根据研究结果来看，由上述构建方法所构建出的视杆细胞条件敲除ift140基因小鼠模型在1月龄时即表现有明显的视网膜变性症状，由此可知，上述小鼠模型可应用于早发严重性视网膜变性的研究中。
27.在一些实施例中，由上述构建方法所构建出的视杆细胞条件敲除ift140基因小鼠模型还可以在筛选用于预防或治疗多器官受累的综合征性纤毛病药物中应用。
28.本发明具有以下有益效果：
29.本发明提供了一种ift140基因视杆细胞条件敲除小鼠模型的构建方法及其应用，本发明首次发现，在小鼠的视网膜视杆细胞中敲除ift140基因即沉默其在视杆细胞中表达，可以使得小鼠表现出视网膜变性疾病相关的特征，例如视网膜明显变薄，色素异常，外层明显萎缩，视锥视杆功能均严重降低，视网膜外层感光细胞萎缩等。因此，本发明构建的视网膜视杆细胞中的ift140基因被敲除的小鼠可以作为视网膜变性疾病模型，为该疾病的研究例如发病过程、机制以及相关药物的筛选提供一种新的模型。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
31.图1为模型小鼠的设计及制作方法；
32.图2为实验例1鼠尾鉴定结果；
33.图3为实验例2中模型鼠的构建和鉴定结果，其中，a为基因敲除路线，b为敲除基因的序列；c为基因型鉴定结果；
34.图4为实验例3中模型鼠的oct扫描结果；
35.图5为实验例3中模型鼠的erg检测结果；
36.图6为实验例3中模型鼠的he染色结果；
37.图7为实验例4中模型鼠的oct扫描结果、he染色结果以及视网膜各层的厚度变化；
38.图8为实验例4中模型鼠的erg检测结果。
具体实施方式
39.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
40.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
41.实施例1
42.本实施例提供了一种ift140基因视杆细胞条件敲除小鼠模型的构建方法。ift140基因敲除的路线参照图1所示，具体操作如下：
43.1)将komp来源(www.komp.org)的靶向ift140基因es细胞系epd0073_5_f01(基因型为ift140
neo
)注射至c57bi/6j小鼠囊胚腔，注射后的囊胚移植到假孕小鼠子宫内获得首建小鼠；
44.2)将步骤1)得到的首建敲除型小鼠和flp小鼠(c57bi/6flp1)交配繁育，获得ift140基因flox杂合子小鼠(ift140
flox/+
)；
45.3)将步骤2)得到的ift140基因flox杂合子小鼠相互交配繁育，得到ift140基因flox纯合子小鼠(ift140
flox/flox
)；
46.4)将步骤3)得到的ift140基因flox纯合子雄鼠与rho-icre雌鼠交配，得到视网膜视杆细胞条件性敲除ift140基因小鼠(rho-icre,ift140
flox/flox
)。
47.实验例1
48.本实验例是对实施例1获得的视网膜视杆细胞条件性敲除ift140基因小鼠的鼠尾进行鉴定，具体方法如下：
49.1)剪小鼠尾梢少许组织样本，置于干净的1.5ml离心管中；
50.2)小鼠dna提取；
51.3)pcr扩增；按照如下体系配置pcr反应体系：
[0052][0053][0054]
上表中预制taq多聚酶混合液来自vazyme,p222-c2。
[0055]
其中，引物序列如下：
[0056]
ift140-loxp-f1序列：5
’‑
tcagccctctatgccactct-3’，seq id no.1；
[0057]
ift140-loxp-r1序列：5
’‑
cttccctatgccttcagcag-3’，seq id no.2；
[0058]
ift140-neo-f2序列：5
’‑
tcagccctctatgccactct-3’，seq id no.3；
[0059]
ift140-neo-r2序列：5
’‑
tggtttgtccaaactcatcaa-3’，seq id no.4；
[0060]
rho-icre-f3序列:5
’‑
tcagtgcctggagttgcgctgtgg-3’，seq id no.5；
[0061]
rho-icre-r3序列:5
’‑
cttaaaggccagggcctgcttggc-3’，seq id no.6。
[0062]
引物ift140-loxp-f1和ift140-loxp-r1用于鉴定loxp插入情况(wildtype:220bp,loxp:269bp)；引物ift140-neo-f2和ift140-neo-r2用于鉴定neo情况(wildtype:0,neo:1099bp)；引物rho-icre-f3和rho-icre-r3用于鉴定cre情况(wildtype:0,cre:550bp)。
[0063]
扩增程序为：
[0064][0065]
扩增结果如图2所示：子代鼠均有loxp插入和野生带，neo检测无带，提示获得ift140-loxp杂合子小鼠[ift140
flox/+
]。结果显示模型鼠loxp纯合，cre阳性。
[0066]
实验例2
[0067]
本实验例是对实施例1获得的视网膜视杆细胞条件性敲除ift140基因小鼠的基因型进行鉴定，方法如下：取实施例1中视杆细胞条件性敲除ift140基因小鼠的视网膜，提取dna，作为模板，进行pcr扩增，按照如下体系配置pcr反应体系：
[0068][0069]
上表中预制taq多聚酶混合液来自vazyme,p222-c2。
[0070]
引物序列如下：
[0071]
bf4：5
’‑
tggccgcaactactaacgaactg-3’，seq id no.7；
[0072]
br2:5
’‑
tcagccctctatgccactcttaa-3’，seq id no.8。
[0073]
bf4和br2用于鉴定敲除基因型(wildtype:948bp,targeted:1149bp,ko:373bp)。
[0074]
扩增程序为：
[0075][0076]
扩增结果如图3所示：从图3中可以看出rho-icre发挥作用，存在ko条带(373bp)。
[0077]
实验例3
[0078]
本实验例是对实施例1获得的视网膜视杆细胞条件性敲除ift140基因小鼠的表型进行鉴定，包括对模型鼠进行眼底彩照、oct和erg检查，取小鼠眼球行石蜡切片he染色。
[0079]
眼底彩照和oct检查的步骤如下：
[0080]
1)复方托吡卡胺滴眼液散瞳；
[0081]
2)1.25％三溴乙醇腹腔麻醉；
[0082]
3)待小鼠完全麻醉后置于操作台上，涂适量唯地息至角膜，以保持角膜湿润透明；
[0083]
4)移动操作台将其中一眼轻轻贴肤micron iv照相机的镜头，待电脑屏幕中出现眼底图像后，调整参数使眼底图片和oct图片清晰，移动操作台的位置，使镜头与小鼠眼睛成不同的角度，对小鼠眼底各象限分别进行拍照和oct的扫描。
[0084]
5)对侧眼进行同样的操作。
[0085]
erg检查的步骤如下：
[0086]
1)实验前一晚对小鼠进行暗适应；
[0087]
2)在暗红光下用复方托吡卡胺滴眼液散瞳三次，每5分钟一次；
[0088]
3)1.25％三溴乙醇腹腔麻醉；
[0089]
4)待小鼠完全麻醉后置于操作台上(恒温37℃)，滴盐酸奥布卡因滴眼液至角膜，以保持角膜湿润并增加导电性；
[0090]
5)将角膜刺激器接触到小鼠角膜上，各电极阻抗小于10千欧，记录不同光强暗适应erg，暗适应erg记录结束后，明适应10分钟，记录不同光强明适应erg。
[0091]
视网膜石蜡切片h&e染色：
[0092]
对1月龄小鼠的视网膜进行石蜡切片、苏木精-伊红染色法(h&e染色方法)染色，具体操作如下：
[0093]
1)快速取小鼠眼球组织，并置于固定液中固定24h；
[0094]
2)石蜡包埋，切片，厚度为4μm；
[0095]
3)切片常规用二甲苯脱蜡，经多级乙醇至水洗：二甲苯(i)5min
→
二甲苯(ⅱ)5min
→
100％乙醇2min
→
95％的乙醇1min
→
80％乙醇1min
→
75％乙醇1min
→
蒸馏水洗2min；
[0096]
4)苏木素染色5分钟，自来水冲洗；
[0097]
5)盐酸乙醇分化30秒；
[0098]
6)自来水浸泡15分钟；
[0099]
7)置伊红液2分钟。
[0100]
8)常规脱水，透明，封片：95％乙醇(i)1min
→
95％乙醇(ⅱ)1min
→
100％乙醇(i)
1min
→
100％乙醇(ⅱ)1min
→
二甲苯石碳酸(3：1)1min
→
二甲苯(i)1min
→
二甲苯(ⅱ)1min
→
中性树脂封固。
[0101]
9)显微镜下拍照。
[0102]
如图4-6所示，以同窝[ift140
flox/flox
]鼠作为对照，图4结果显示[rho-icre,ift140
flox/flox
]小鼠视网膜明显变薄，色素异常，oct显示外层明显萎缩，图5的erg显示视锥视杆功能均严重降低，图6的he染色结果显示视网膜外层感光细胞萎缩。
[0103]
另外，本实验例所采用的小鼠为1月龄，从实验结果来看，1月龄即有如此明显的视网膜变性症状，可以证明ift140基因缺失会造成早发严重性视网膜变性。
[0104]
实验例4
[0105]
本实验例是对实施例1获得的视网膜视杆细胞条件性敲除ift140基因小鼠的自然病程观察，包括视网膜结构和功能的改变。
[0106]
取不同年龄段(pn10，pn15，pn20和pn25)模型鼠和同窝对照鼠，每组三只。
[0107]
a.进行oct和erg数据采集。
[0108]
b.取眼球进行石蜡包埋he切片，观察视网膜各层厚度的改变。
[0109]
如图7-8所示，以同窝[ift140
flox/flox
]鼠作为对照，结果显示[rho-icre,ift140
flox/flox
]小鼠视网膜结构和功能进行性退化。图7中显示从小鼠生后15天开始，至生后25天oct显示外层明显萎缩(图7-a)、he染色结果显示视网膜外层感光细胞明显萎缩消失(图7-b)，图7-c中显示了视网膜各层厚度变化。图8中显示生后30天erg显示视锥视杆功能均严重降低至平波。
[0110]
观察记录自然病程，结果进一步证明ift140基因缺失造成早发严重性视网膜变性。
[0111]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。