利用外源茉莉酸缓解玉米瘤黑粉病的方法

1.本发明涉及农业应用技术领域，尤其涉及利用外源茉莉酸缓解玉米瘤黑粉病的方法。


背景技术：

2.玉米瘤黑粉病是一种由真菌引起的局部性病害，发病极为普遍，是一种世界性病害，近年来，由于玉米种植面积连年扩大，重茬地块增多，旱涝交替等气候异常，土壤中黑粉菌厚垣孢子逐年积累，玉米瘤黑粉病的发生呈逐年上升趋势。
3.对于玉米病害，加强田间栽培管理，调整播期及合理施肥，同时使用化学药剂防治，可有效控制病情发展。这种农业措施和药剂处理在一定程度上能够降低发病程度，但存在成本高、污染环境和防护作用不稳定等问题。
4.茉莉酸(jasmonic acid，ja)是植物体内的调节性物质，能诱导植物产生防御蛋白参与植物对病原菌的防御，ja及其甲酯能诱导植物合成参与防卫反应的物质如尼古丁、苜蓿碱等；目前，已经明确ja可作为植物抗逆反应所需的信号分子来激活植物防御保护机制，在植物的抗逆过程中起着关键作用，因此探讨外源茉莉酸对缓解玉米幼苗瘤黑粉病的可能生理机制是非常必要的，对提高玉米抗病及保障粮食安全具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是解决现有技术存在的以下问题：已经明确ja可作为植物抗逆反应所需的信号分子来激活植物防御保护机制，在植物的抗逆过程中起着关键作用，因此探讨外源茉莉酸对缓解玉米幼苗瘤黑粉病的可能生理机制是非常必要的，对提高玉米抗病及保障粮食安全具有重要意义。
6.为解决现有技术存在的问题，本发明提供利用外源茉莉酸缓解玉米瘤黑粉病的方法，包括茉莉酸溶液，所述茉莉酸溶液的浓度为0.01-1mmol
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，将所述茉莉酸溶液施加在玉米幼苗叶片表面，至玉米幼苗叶片湿润。
7.优选的，所述茉莉酸溶液浓度为0.1mmol
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。
8.优选的，在所述玉米幼苗六叶一心期时施加所述茉莉酸溶液。
9.与相关技术相比较，本发明提供的利用外源茉莉酸缓解玉米瘤黑粉病的方法具有如下有益效果：
10.本发明主要通过设计多个茉莉酸浓度，进行瘤黑粉菌接种后茉莉酸对玉米幼苗pod、ppo、pal、mda、β-1,3-ga等指标的测定，探讨外源茉莉酸对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗病情指数和生理生化特性的影响，明确茉莉酸诱导玉米幼苗抗瘤黑粉病可能的生理机制，对缓解病害对植株的伤害，具有很高的应用价值，应用潜力很大。
附图说明
11.图1为ja处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗mda含量的影响；
12.图2为ja处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗ppo活性的影响；
13.图3为ja处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗pal活性的影响；
14.图4为ja处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗pod活性的影响；
15.图5为ja处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗β-1，3-ga活性的影响。
具体实施方式
16.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
17.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
18.实施例一
19.利用外源茉莉酸缓解玉米瘤黑粉病的方法，采用茉莉酸溶液喷洒在六叶一心期的玉米幼苗的叶片表面，至玉米幼苗叶片湿润；
20.缓解玉米幼苗瘤黑粉病的最适ja浓度的筛选方法，按以下步骤进行：
21.1、材料准备：玉米自交系“掖478”种子和“齐319”种子，茉莉酸和玉米瘤黑粉菌溶液配置。
22.2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，玉米种子用0.5％的次氯酸钠消毒10min，用蒸馏水冲洗4次，用无菌滤纸吸干附着的水，得玉米消毒种子。
23.3、试材培育：将处理后的玉米种子播种到垫有两层滤纸的直径为15cm的培养皿中，置于25℃培养箱中发芽。玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到直径为32cm塑料花盆中，每盆植苗4株，每个处理6次重复；在温室进行培养，温室的湿度调至80％，温度为27℃条件下培养24h，然后置于正常温湿度环境下继续培养培养，每天每盆定量浇800ml水；待长至六叶一心期时，对玉米幼苗接种瘤黑粉菌。
24.4、试验处理：
25.4.1试验首先是供试菌种与接种液的制备：玉米瘤黑粉菌，取自甘肃农业大学平凉育种站，使用时将冬孢子充分碾碎，过40目筛后收集均一菌粉，每10g菌粉加水1l，充分搅拌后300目筛网过滤(现用现配)；
26.4.2接种方法采用注射法：在玉米植株六叶一心期，用注射器吸取制备好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1ml，见心叶冒液即可，对照组在相同部位注射等量的蒸馏水。
27.4.3以注射玉米瘤黑粉菌液作为胁迫条件，ja溶液的浓度设定为：ja1mmol
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，待步骤3所得的玉米幼苗长至六叶一心期时，接种玉米瘤黑粉菌12h后，喷施步骤4.3配制的各种浓度的ja至叶片湿润然后进行病情指数和各种生理指标测定；
28.5、各项指标的测定：分别对不同浓度ja处理时间为0、12、48、72、96h的玉米叶片进行丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(pod)活性、多酚氧化酶(ppo)活性、苯丙氨酸解氨酶(pal)活性、β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-ga)活性的测定，处理7d后统计玉米植株发病情况并计算病情指数(di)和诱抗效果。
29.实施例二
30.缓解玉米幼苗瘤黑粉病的最适ja浓度的筛选方法，按以下步骤进行：
31.1、材料准备：玉米自交系“掖478”种子和“齐319”种子，茉莉酸和玉米瘤黑粉菌溶液配置。
32.2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，玉米种子用0.5％的次氯酸钠消毒10min，用蒸馏水冲洗4次，用无菌滤纸吸干附着的水，得玉米消毒种子。
33.3、试材培育：将处理后的玉米种子播种到垫有两层滤纸的直径为15cm的培养皿中，置于25℃培养箱中发芽。玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到直径为32cm塑料花盆中，每盆植苗4株，每个处理6次重复；在温室进行培养，温室的湿度调至80％，温度为27℃条件下培养24h，然后置于正常温湿度环境下继续培养培养，每天每盆定量浇800ml水；待长至六叶一心期时，对玉米幼苗接种瘤黑粉菌。
34.4、试验处理：
35.4.1试验首先是供试菌种与接种液的制备：玉米瘤黑粉菌，取自甘肃农业大学平凉育种站，使用时将冬孢子充分碾碎，过40目筛后收集均一菌粉，每10g菌粉加水1l，充分搅拌后300目筛网过滤(现用现配)；
36.4.2接种方法采用注射法：在玉米植株六叶一心期，用注射器吸取制备好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1ml，见心叶冒液即可，对照组在相同部位注射等量的蒸馏水。
37.4.3以注射玉米瘤黑粉菌液作为胁迫条件，ja溶液的浓度设定为：ja0.5mmol
·
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，待步骤3所得的玉米幼苗长至六叶一心期时，接种玉米瘤黑粉菌12h后，喷施步骤4.3配制的各种浓度的ja至叶片湿润然后进行病情指数和各种生理指标测定；
38.5、各项指标的测定：分别对不同浓度ja处理时间为0、12、48、72、96h的玉米叶片进行丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(pod)活性、多酚氧化酶(ppo)活性、苯丙氨酸解氨酶(pal)活性、β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-ga)活性的测定，处理7d后统计玉米植株发病情况并计算病情指数(di)和诱抗效果。
39.实施例三
40.缓解玉米幼苗瘤黑粉病的最适ja浓度的筛选方法，按以下步骤进行：
41.1、材料准备：玉米自交系“掖478”种子和“齐319”种子，茉莉酸和玉米瘤黑粉菌溶液配置。
42.2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，玉米种子用0.5％的次氯酸钠消毒10min，用蒸馏水冲洗4次，用无菌滤纸吸干附着的水，得玉米消毒种子。
43.3、试材培育：将处理后的玉米种子播种到垫有两层滤纸的直径为15cm的培养皿中，置于25℃培养箱中发芽。玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到直径为32cm塑料花盆中，每盆植苗4株，每个处理6次重复；在温室进行培养，温室的湿度调至80％，温度为27℃条件下培养24h，然后置于正常温湿度环境下继续培养培养，每天每盆定量浇800ml水；待长至六叶一心期时，对玉米幼苗接种瘤黑粉菌。
44.4、试验处理：
45.4.1试验首先是供试菌种与接种液的制备：玉米瘤黑粉菌，取自甘肃农业大学平凉育种站，使用时将冬孢子充分碾碎，过40目筛后收集均一菌粉，每10g菌粉加水1l，充分搅拌后300目筛网过滤(现用现配)；
46.4.2接种方法采用注射法：在玉米植株六叶一心期，用注射器吸取制备好的菌液注
射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1ml，见心叶冒液即可，对照组在相同部位注射等量的蒸馏水。
47.4.3以注射玉米瘤黑粉菌液作为胁迫条件，ja溶液的浓度设定为：ja0.1mmol
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，待步骤3所得的玉米幼苗长至六叶一心期时，接种玉米瘤黑粉菌12h后，喷施步骤4.3配制的各种浓度的ja至叶片湿润然后进行病情指数和各种生理指标测定；
48.5、各项指标的测定：分别对不同浓度ja处理时间为0、12、48、72、96h的玉米叶片进行丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(pod)活性、多酚氧化酶(ppo)活性、苯丙氨酸解氨酶(pal)活性、β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-ga)活性的测定，处理7d后统计玉米植株发病情况并计算病情指数(di)和诱抗效果。
49.实施例四
50.缓解玉米幼苗瘤黑粉病的最适ja浓度的筛选方法，按以下步骤进行：
51.1、材料准备：玉米自交系“掖478”种子和“齐319”种子，茉莉酸和玉米瘤黑粉菌溶液配置。
52.2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，玉米种子用0.5％的次氯酸钠消毒10min，用蒸馏水冲洗4次，用无菌滤纸吸干附着的水，得玉米消毒种子。
53.3、试材培育：将处理后的玉米种子播种到垫有两层滤纸的直径为15cm的培养皿中，置于25℃培养箱中发芽。玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到直径为32cm塑料花盆中，每盆植苗4株，每个处理6次重复；在温室进行培养，温室的湿度调至80％，温度为27℃条件下培养24h，然后置于正常温湿度环境下继续培养培养，每天每盆定量浇800ml水；待长至六叶一心期时，对玉米幼苗接种瘤黑粉菌。
54.4、试验处理：
55.4.1试验首先是供试菌种与接种液的制备：玉米瘤黑粉菌，取自甘肃农业大学平凉育种站，使用时将冬孢子充分碾碎，过40目筛后收集均一菌粉，每10g菌粉加水1l，充分搅拌后300目筛网过滤(现用现配)；
56.4.2接种方法采用注射法：在玉米植株六叶一心期，用注射器吸取制备好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1ml，见心叶冒液即可，对照组在相同部位注射等量的蒸馏水。
57.4.3以注射玉米瘤黑粉菌液作为胁迫条件，ja溶液的浓度设定为：ja0.01mmol
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，待步骤3所得的玉米幼苗长至六叶一心期时，接种玉米瘤黑粉菌12h后，喷施步骤4.3配制的各种浓度的ja至叶片湿润然后进行病情指数和各种生理指标测定；
58.5、各项指标的测定：分别对不同浓度ja处理时间为0、12、48、72、96h的玉米叶片进行丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(pod)活性、多酚氧化酶(ppo)活性、苯丙氨酸解氨酶(pal)活性、β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-ga)活性的测定，处理7d后统计玉米植株发病情况并计算病情指数(di)和诱抗效果。
59.实施例五
60.缓解玉米瘤黑粉病的最适茉莉酸浓度的筛选方法，按以下步骤进行：
61.1、材料准备：玉米自交系“掖478”种子和“齐319”种子，茉莉酸和玉米瘤黑粉菌溶液配置。
62.2、种子处理：选取色泽正常、籽粒饱满、整齐一致的玉米种子，玉米种子用0.5％的
次氯酸钠消毒10min，用蒸馏水冲洗4次，用无菌滤纸吸干附着的水，得玉米消毒种子。
63.3、试材培育：将处理后的玉米种子播种到垫有两层滤纸的直径为15cm的培养皿中，置于25℃培养箱中发芽。玉米出苗后，选取生长一致的三叶一心期的幼苗转移到直径为32cm塑料花盆中，每盆植苗4株，每个处理6次重复；在夏天正常日光中培养，每天每盆定量浇800ml水；待长至六叶一心期时，对玉米幼苗接种瘤黑粉菌。
64.4、试验处理：
65.4.1试验首先是供试菌种与接种液的制备：玉米瘤黑粉菌，取自甘肃农业大学平凉育种站，使用时将冬孢子充分碾碎，过40目筛后收集均一菌粉，每10g菌粉加水1l，充分搅拌后300目筛网过滤(现用现配)；
66.4.2接种方法采用注射法：在玉米植株六叶一心期，用注射器吸取制备好的菌液注射到玉米植株的中下部，每株注入菌液1ml，见心叶冒液即可，对照组在相同部位注射等量的蒸馏水。
67.4.3以注射玉米瘤黑粉菌液作为胁迫条件，使用ck(0.00mmol
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，即双蒸水)替代茉莉酸溶液，即茉莉酸溶液的浓度设定为sa 0mmol
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，待步骤3所得的玉米幼苗长至六叶一心期时，接种玉米瘤黑粉菌12h后，喷施步骤4.3配制的各种浓度的茉莉酸至叶片湿润然后进行病情指数和各种生理指标测定；
68.5、各项指标的测定：分别对不同浓度茉莉酸处理时间为0、12、48、72、96h的玉米叶片进行丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(pod)活性、多酚氧化酶(ppo)活性、苯丙氨酸解氨酶(pal)活性、β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-ga)活性的测定，处理7d后统计玉米植株发病情况并计算病情指数(di)和诱抗效果。
69.各实施例结果与分析
70.玉米瘤黑粉病发病等级：
71.玉米瘤黑粉病发病等级参考严理等的调查方法，，结合玉米瘤黑粉病自身的发病程度与特征，分别对不同浓度茉莉酸处理的玉米植株进行病情调查，每株按0、1、2、3、4等级分级统计，并计算病情指数(di)，筛选出最佳茉莉酸缓解玉米瘤黑粉病最佳浓度。玉米瘤黑粉病的分级标准见表1，试验结果见表2。
72.病情指数(di)＝∑(各级病株数
×
发病级数)
×
100/(最高病级数
×
调查总株数)
73.表1玉米瘤黑粉病的调查分级标准
[0074][0075]
表2表示采用不同浓度的茉莉酸处理(0、0.01、0.1、0.5和1mmol
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)玉米自交系掖478后，玉米瘤黑粉病病情指数发生明显的差异。接种玉米瘤黑粉菌12h后喷施茉莉酸至
叶片湿润，7d后对植株进行发病等级与病情指数统计，结果(表2)表明：喷施茉莉酸7d后，4种浓度的茉莉酸对玉米诱导处理后玉米瘤黑粉病的病情指数明显下降，与对照相比，四种不同浓度的茉莉酸处理玉米后其病情指数均有不同程度的降低，浓度为0.1mmol
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茉莉酸处理玉米后病情指数为25％，对玉米抗瘤黑粉病的诱导效果最好，诱抗效果达52.65％，与对照相比差异显著。茉莉酸浓度为0.01mmol
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和1mmol
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处理后对玉米黑粉病的病情指数逐渐变低。浓度为0.5mmol
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茉莉酸处理后诱抗效果与0.1mmol
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相比次之，病情指数为44.4％。以上结果说明一定浓度的茉莉酸对玉米瘤黑粉病有诱抗效果。
[0076]
各项生理指标的测定：茉莉酸诱导处理完成后0、12、48、72、96h取样，将齐319和掖478玉米幼苗用蒸馏水冲洗干净，取玉米幼苗叶进行各项指标测定，各项指标包括mda含量、pod、ppo、pal、β-1,3-ga活性。
[0077]
测定结果如下：
[0078]
(1)茉莉酸处理对玉米瘤黑粉病病情指数及诱抗效果的影响见表2；由表2可以得出：与对照相比，添加不同浓度的茉莉酸后，各浓度茉莉酸处理均比对照处理的病情指数有所下降，表明茉莉酸可以缓解玉米瘤黑粉病对玉米幼苗生长的影响，由不同处理显著性差异看来，0.1mmol/l-1
为茉莉酸缓解的最适浓度；
[0079]
表2茉莉酸处理对玉米植株病情指数及诱抗效果的影响
[0080][0081]
注：不同小写字母代表不同处理间在0.05水平差异显著，下同。
[0082]
(2)茉莉酸处理对接种瘤黑粉菌后玉米幼苗生理特性的影响见图3、图4、图5；
[0083]
由图1可以看出：未用茉莉酸处理玉米幼苗的mda含量高于茉莉酸处理，处理48h时齐319ja接种比ck接种处理降低了58.63％，掖478ja接种比ck接种处理降低了42.23％。玉米接种瘤黑粉菌时，ja处理的mda含量低于ck-未接种处理，齐319mda含量整体低于掖478，说明齐319的抗病性强于掖478，以上结果说明外源施用茉莉酸能够减轻瘤黑粉病发生对玉米植株内膜系统造成的伤害。
[0084]
由图2可以看出：各处理组ppo活力变化显著(p《0.05)，其变化趋势也相似，活性高峰出现在48h。两个玉米自交系ja接种处理的玉米ppo活性均显著高于ck接种组(p《0.05)，掖478ja接种处理的比掖478ck接种组高40.24％，齐319ja接种处理的比齐319ck接种的ppo活性高44.96％，玉米未接种瘤黑粉病菌时，经ja未接种处理的玉米幼苗ppo活性也显著高于ck未接种处理的玉米幼苗，抗性自交系齐319整体酶活性高于感病自交系掖478，以上结果说明0.1mmol
·
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的茉莉酸能够调控植物体内ppo的活性升高。
[0085]
由图3可以看出：两个玉米自交系齐319和掖478在四种处理下玉米幼苗pal活性整体变化趋势相同且无明显差异。经ja处理的玉米pal活性比未用ja处理的酶活性高，但差异
不显著(p《0.05)；齐319的pal整体活性高于掖478的整体活性，说明齐319的抗逆性强于掖478。以上结果说明ja对植物体内pal的活性作用不显著。
[0086]
由图4可以看出：各处理组与对照组之间在整个处理期间pod活性变化显著(p《0.05)，48h时两个玉米自交系ck接种、ja未接种和ja接种处理的pod酶活性都比ck未接种处理组高。玉米接种瘤黑粉菌后，齐319和掖478ja接种处理的玉米pod活性显著高于对照组(p《0.05)，分别高于各自ck接种处理44.6％和43.49％。齐319整体酶活性高于掖478，符合两个自交系的抗性。由此可见，用ja处理玉米后能够促使玉米中pod活性升高。
[0087]
由图5可以看出：各处理组活力变化显著(p《0.05)，其变化趋势也相似，先升高后降低，活性高峰出现在48h。两个玉米自交系ja接种处理的玉米β-1,3-ga活性均显著高于ck接种组(p《0.05)，掖478ja接种处理的比其ck接种组高45.35％，齐319ja接种处理的比其ck接种的玉米β-1,3-ga活性高50.41％。玉米未接种瘤黑粉病菌时，经ja未接种处理的玉米β-1,3-ga活性也显著高于ck未接种处理组(p《0.05)，抗性自交系齐319整体酶活性高于感病自交系掖478，以上结果说明0.1mmol
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的ja能够调控植物体内β-1,3-ga的活性升高。
[0088]
结果分析与最适茉莉酸浓度筛选：采用microsoft excel 2019软件进行数据处理，所有试验数据统计分析spss26.0进行处理，试验结果用平均值
±
标准偏差(sd)表示，采用duncan’s新复极差法进行多重比较，对各处理进行显著性差异分析。
[0089]
从以上实例可以看出，外源茉莉酸可有效提高玉米黑粉病胁迫下玉米叶片中的抗氧化酶活性，降低其体内活性氧含量，从而减轻玉米黑粉病对植株的伤害。采用外源茉莉酸处理在实践中易操作，有实效，有望成为实践中改善玉米瘤黑粉病的好方法，应用潜力很大。