一种桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法与流程

1.本发明属蕨类植物组织培养领域，具体涉及桫椤无菌孢子的获取、桫椤孢子诱导配子体、桫椤ggb诱导增殖、桫椤ggb分化、孢子体生根、桫椤组培苗移栽；旨在获得大量的桫椤再生植株，以解决桫椤自然萌发率低和种质资源不足问题。


背景技术：

2.桫椤（alsophila spinulosa (wall. ex hook.) r. m. tryon），属桫椤科（cyatheaceae）、桫椤属（alsophila），是现存唯一的木本蕨类植物，老蕨类家族的后裔，界于低等与高等植物之间。桫椤主要分布于温暖潮湿的热带及亚热带地区，我国主要分布于贵州、重庆、四川等多个省地。桫椤在《国家重点保护野生植物名录》中被列为国家二级保护植物，在《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录中被列为附录ⅱ物种。桫椤具有观赏、药用以及学术等多方面的价值，比如桫椤树形高雅飘逸、青翠碧绿，直立的树状茎和排列整齐的孢子囊群是自然界的一大奇观；在药用价值上，它的茎、叶片富含黄酮、萜类、酚类、有机酸等药用物质；而学术价值上，桫椤对生长环境的特别性，在一定程度上能做指示植物。桫椤还具有古老性与孑遗性，这对研究植物系统发育和生物进化具有深刻意义。桫椤遗传的多样性、生态位的局限、生境的消减以及害虫的取食，使其逐渐致频。因此探究适合桫椤高效的繁殖方法迫在眉睫。
3.桫椤的孢子繁殖周期长，其配子体时期的精子器与颈卵器需水作为媒介才能受精成功，故自然条件下受精困难，难以形成孢子体。虽然桫椤孢子产出量大，但在实际野外调查发现土壤表层桫椤幼苗极少。植物组织培养技术作为一种高效的无性繁殖方法，具有繁殖周期短，繁殖效率高和不受季节限制等特点。因此借助组织培养技术来探究桫椤发育历程、繁衍桫椤是目前最直接、最简便、最有效的方法。
4.绿色球状体途径是蕨类植物特有的繁殖途径，由外植体诱导增殖得到的由众多绿色颗粒组成的ggb。同样地，桫椤孢子在适宜培养条件下，其诱导的配子体经生长、发育和不断增殖形成ggb，通过此途径进一步分化诱导成再生植株，其繁殖效率高于野外孢子繁殖及人工土培繁殖，具有分化快、成苗周期短等优点。桫椤通过组培快繁方面的文章极少，未见珍稀濒危蕨类植物桫椤通过ggb途径组培扩繁研究的相关报道。运用组培技术成功构建桫椤ggb繁殖体系，对珍稀濒危植物桫椤的种群数量扩大，缓解濒危程度具有重大的意义。
5.目前，经过检索发现现有专利中对桫椤的组织培养的相关专利如下：现有专利1（cn115029294a）公开了一种桫椤孢子无菌繁殖的方法，跟本发明的区别在于运用组培方法路径不同，孢子的培养、增值、诱导方法均不同；现有专利2（cn110432154a）公开了一种桫椤组织的培养方法，与本发明的培养方法不同、诱导路径不同、外植体的处理方法不同；现有专利3（cn110432154a）公开了一种中华桫椤绿色球状体途径的组培方法，与本发明区别在于虽然两种桫椤都属桫椤科、桫椤属，但不是一个物种，具有一定的差异，两者的诱导ggb材料不同，因此诱导出的绿色球状体不同，并且诱导和分化的方法不同。本发明研究通过ggb途径来扩繁桫椤，使其ggb诱导率100%，ggb分化率92%，生根率、移栽成活率都为100%，为产
业化生产桫椤增添技术支持。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，提供一种桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法。本发明通过ggb途径来扩繁桫椤。其诱导率、分化率、生根率、移栽成活率高，克服了桫椤的繁衍能力低，种群数量低，通过孢子繁殖途径周期长、效率低等技术问题。
7.本发明的技术方案：一种桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法，所述方法是先获取桫椤无菌孢子，将桫椤无菌孢子诱导成配子体，再进行桫椤ggb的诱导增殖、桫椤ggb分化诱导、桫椤孢子体生根诱导、桫椤再生植株驯化练苗和移栽。
8.前述的桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法，所述方法包括以下步骤：（1）桫椤无菌孢子获取：取成熟的桫椤孢子置于离心管中，加入蒸馏水浸泡，离心，移液枪去除上清液，在超净工作台上用75%酒精消毒，待孢子上下分层，去除上清液，用灭菌后的蒸馏水清洗，再用4% naclo溶液消毒，摇晃离心管后静置分层，去除上清液，用无菌水清洗，最后加入无菌水，制成a品；（2）桫椤孢子诱导配子体：将a品接种于诱导配子体培养基上，在温度25
±
2℃、湿度80
±
2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月，得到b品；（3）桫椤ggb的诱导增殖：将b品切割成4
×
4mm的方块，接种的配子体的初始鲜重0.08-0.12g，接种在诱导增殖ggb培养基上，在温度25
±
2℃、湿度80
±
2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月，得到c品；（4）桫椤ggb分化诱导：将c品每隔15天，喷洒一次无菌水，促进c品受精，继续培养30天后，将c品分割为直径的1
ꢀ‑
1.5 cm的小球，接种到ggb分化诱导培养基中, 在温度25
±
2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月后，得到d品；（5）桫椤孢子体生根诱导：取d品转接至生根诱导培养基诱导其生根，在温度25
±
2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养1个月，得到e品；（6）桫椤再生植株驯化、炼苗和移栽：选取苗高达到5-10 cm的e品在人工气候室驯化、练苗后移栽至不同的基质中，在温度25
±
2℃，湿度89
±
2%，光质为白光，光周期16 h/d，培养1个月移栽到大棚进行常态化管理。
9.前述步骤（1）中，桫椤无菌孢子获取：取成熟的桫椤孢子置于离心管中，加入50 ml的蒸馏水浸泡12 h，4500 r/min条件下离心机离心4 min，移液枪去除上清液，在超净工作台上用40-50 ml的75%酒精消毒30 s，静置90s，待孢子上下分层，去除上清液，用无菌水清洗3次，再用40-50ml的4% naclo溶液消毒，摇晃离心管4 min后静置分层，去除上清液，用无菌水清洗7-8次，再加入20-30 ml无菌水，制成a品。
10.前述步骤（2）中，诱导配子体培养基是由1/8ms+0.5mg/l的6-ba+0.1mg/l的2,4-d+20g/l蔗糖+16 g/l琼脂组成，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
11.具体的说，前述步骤（2）中，1/8ms是由0.125份大量元素、1份铁盐、1份微量元素和1份有机物制成；
所述大量元素是由1650mg/l硝酸铵+1900mg/l硝酸钾+440mg/l氯化钙+370mg/l硫酸镁+170mg/l磷酸二氢钾而制成；所述铁盐是由27.85mg/l硫酸亚铁+37.25mg/l乙二胺四乙酸二钠而制成；所述微量元素是由0.83mg/l碘化钾+6.2mg/l的硼酸+22.3mg/l硫酸锰+8.6mg/l硫酸锌+0.25mg/l钼酸钠+0.025mg/l硫酸铜+0.025mg/l氯化钴而制成；所述有机物是由100mg/l肌醇+0.5mg/l烟酸+0.5mg/l盐酸吡哆醇+0.1mg/l盐酸硫胺素+2mg/l甘氨酸而制成。前述步骤（3）中，所述诱导增殖ggb培养基是由1/2ms+0.3 mg/l的6-ba+0.4 mg/l 的naa+30 g/l蔗糖+6 g/l的琼脂组成，再使用1 mol/l 的naoh和1 mol/l 的hcl调至ph值为5.80。
12.前述步骤（4）中，ggb分化诱导培养基是由1/2ms+0.３mg/l 的kt+0.4 mg/l 的iba+30 g/l蔗糖+6 g/l琼脂组成，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
13.前述步骤（5）中，生根诱导培养基为：1/2ms+0.7 mg/l 的iaa+30 g/l蔗糖+6 g/l琼脂，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
14.前述步骤（6）中，基质为：红壤:腐殖土=1:1、黄壤:腐殖土=1:1或红壤:黄壤:腐殖土=2:2:1。
15.具体的说，前述步骤（6）中，基质为：红壤:腐殖土=1:1。
16.本发明与现有技术比较，具有以下优点：1、提高桫椤繁殖效率。成功诱导出桫椤的ggb，其增殖诱导率达100%，增殖倍数达10倍，并且诱导的ggb能不断增殖，本发明实现了桫椤扩繁的高效增殖。
17.2、桫椤组培苗的繁殖周期大幅度缩短。桫椤ggb的分化率92%、生根率100%、桫椤组培苗移栽成活率100%。分化培养基与生根培养基能让桫椤ggb的根、茎、叶分化，加快了桫椤组培苗的成活与产出时间。
18.3、突破了桫椤配子体受精、孢子体诱导、孢子体生根、再生植株炼苗的困难，显著提高再生植株成活率。对实现珍稀濒危蕨类植物桫椤扩繁、种质资源离体保存具有重要意义，为规模生产及应用奠定基础。
附图说明
19.图1桫椤的孢子；图2桫椤孢子开始生长，含叶绿素的原始细胞增殖以及不含叶绿素的假根突破孢子囊；图3桫椤孢子生长出现片状体；图4桫椤片状体发育为蝶形原叶体；图5桫椤配子体；图6桫椤配子体诱导ggb；图7成熟配子体精子器；图8受精成功的ggb；图9切分后的ggb开始分化；图10分化出茎叶根的孢子体；
图11桫椤孢子体幼苗；图12移栽成活的桫椤幼苗。
20.具体的实施方式：实施例1：（1）桫椤无菌孢子获取：取成熟的桫椤孢子置于离心管中，加入50 ml的蒸馏水浸泡12 h，4500 r/min条件下离心机离心4 min，移液枪去除上清液，在超净工作台上用45 ml的75%酒精消毒30 s，静置90s，待孢子上下分层，去除上清液，用无菌水清洗3次，再用45ml的4% naclo溶液消毒，摇晃离心管4 min后静置分层，去除上清液，用无菌水清洗7次，再加入25 ml无菌水，制成无菌孢子悬浮液。
21.（2）桫椤孢子诱导配子体：将制成无菌孢子悬浮液接种于诱导配子体培养基上，在温度25
±
2℃、湿度80
±
2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月，得到配子体；诱导配子体培养基是由1/8ms+0.5mg/l的6-ba+0.1mg/l的2,4-d+20g/l蔗糖+16 g/l琼脂组成，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
22.1/8ms是由0.125份大量元素、1份铁盐、1份微量元素和1份有机物制成；大量元素是由1650mg/l硝酸铵+1900mg/l硝酸钾+440mg/l氯化钙+370mg/l硫酸镁+170mg/l磷酸二氢钾而制成；铁盐是由27.85mg/l硫酸亚铁+37.25mg/l乙二胺四乙酸二钠而制成；微量元素是由0.83mg/l碘化钾+6.2mg/l的硼酸+22.3mg/l硫酸锰+8.6mg/l硫酸锌+0.25mg/l钼酸钠+0.025mg/l硫酸铜+0.025mg/l氯化钴而制成；有机物是由100mg/l肌醇+0.5mg/l烟酸+0.5mg/l盐酸吡哆醇+0.1mg/l盐酸硫胺素+2mg/l甘氨酸而制成。（3）桫椤ggb的诱导增殖：将配子体切割成4
×
4mm的方块，接种的配子体的初始鲜重0.1g，接种在诱导增殖ggb培养基上，在温度25
±
2℃、湿度80
±
2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月，得到桫椤ggb；诱导增殖ggb培养基是由1/2ms+0.3 mg/l的6-ba+0.4 mg/l 的naa+30 g/l蔗糖+6 g/l的琼脂组成，再使用1 mol/l 的naoh和1 mol/l 的hcl调至ph值为5.80。
23.（4）桫椤ggb分化诱导：将桫椤ggb的诱导增殖体每隔15天，喷洒一次无菌水，促进桫椤ggb受精，继续培养30天后，将桫椤ggb分割为直径的1
ꢀ‑
1.5 cm的小球，接种到ggb分化诱导培养基中, 在温度25
±
2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月后，桫椤ggb形成孢子体；ggb分化诱导培养基是由1/2ms+0.３mg/l 的kt+0.4 mg/l 的iba+30 g/l蔗糖+6 g/l琼脂组成，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
24.（5）桫椤孢子体生根诱导：取孢子体转接至生根诱导培养基诱导其生根，在温度25
±
2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养1个月，得到桫椤再生植株；生根诱导培养基为：1/2ms+0.7 mg/l 的iaa+30 g/l蔗糖+6 g/l琼脂，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
25.（6）桫椤再生植株驯化、炼苗和移栽：选取苗高达到7cm的桫椤再生植株在人工气
候室驯化、练苗后移栽至红壤:腐殖土=1:1的基质中，在温度25
±
2℃，湿度89
±
2%，光质为白光，光周期16 h/d，培养1个月移栽到大棚进行常态化管理。
26.实施例2：（1）桫椤无菌孢子获取：取成熟的桫椤孢子置于离心管中，加入50 ml的蒸馏水浸泡12 h，4500 r/min条件下离心机离心4 min，移液枪去除上清液，在超净工作台上用40 ml的75%酒精消毒30 s，静置90s，待孢子上下分层，去除上清液，用无菌水清洗3次，再用40ml的4% naclo溶液消毒，摇晃离心管4 min后静置分层，去除上清液，用无菌水清洗8次，再加入20 ml无菌水，制成无菌孢子悬浮液。
27.（2）桫椤孢子诱导配子体：将制成无菌孢子悬浮液接种于诱导配子体培养基上，在温度25
±
2℃、湿度80
±
2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月，得到桫椤孢子诱导配子体；诱导配子体培养基是由1/8ms+0.5mg/l的6-ba+0.1mg/l的2,4-d+20g/l蔗糖+16 g/l琼脂组成，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
28.1/8ms是由0.125份大量元素、1份铁盐、1份微量元素和1份有机物制成；大量元素是由1650mg/l硝酸铵+1900mg/l硝酸钾+440mg/l氯化钙+370mg/l硫酸镁+170mg/l磷酸二氢钾而制成；铁盐是由27.85mg/l硫酸亚铁+37.25mg/l乙二胺四乙酸二钠而制成；微量元素是由0.83mg/l碘化钾+6.2mg/l的硼酸+22.3mg/l硫酸锰+8.6mg/l硫酸锌+0.25mg/l钼酸钠+0.025mg/l硫酸铜+0.025mg/l氯化钴而制成；有机物是由100mg/l肌醇+0.5mg/l烟酸+0.5mg/l盐酸吡哆醇+0.1mg/l盐酸硫胺素+2mg/l甘氨酸而制成。（3）桫椤ggb的诱导增殖：将桫椤孢子诱导配子体切割成4
×
4mm的方块，接种的配子体的初始鲜重0.08g，接种在诱导增殖ggb培养基上，在温度25
±
2℃、湿度80
±
2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月，得到桫椤ggb；诱导增殖ggb培养基是由1/2ms+0.3 mg/l的6-ba+0.4 mg/l 的naa+30 g/l蔗糖+6 g/l的琼脂组成，再使用1 mol/l 的naoh和1 mol/l 的hcl调至ph值为5.80。
29.（4）桫椤ggb分化诱导：将桫椤ggb的诱导增殖体每隔15天，喷洒一次无菌水，促进c品受精，继续培养30天后，将c品分割为直径的1-1.5 cm的小球，接种到ggb分化诱导培养基中, 在温度25
±
2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月后，桫椤ggb形成孢子体；ggb分化诱导培养基是由1/2ms+0.３mg/l 的kt+0.4 mg/l 的iba+30 g/l蔗糖+6 g/l琼脂组成，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
30.（5）桫椤孢子体生根诱导：取孢子体转接至生根诱导培养基诱导其生根，在温度25
±
2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养1个月，得到桫椤再生植株；生根诱导培养基为：1/2ms+0.7 mg/l 的iaa+30 g/l蔗糖+6 g/l琼脂，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
31.（6）桫椤再生植株驯化、炼苗和移栽：选取苗高达到8 cm的桫椤再生植株在人工气候室驯化、练苗后移栽至黄壤:腐殖土=1:1的基质中，在温度25
±
2℃，湿度89
±
2%，光质为
白光，光周期16 h/d，培养1个月移栽到大棚进行常态化管理。
32.实施例3：（1）桫椤无菌孢子获取：取成熟的桫椤孢子置于离心管中，加入50 ml的蒸馏水浸泡12 h，4500 r/min条件下离心机离心4 min，移液枪去除上清液，在超净工作台上用50 ml的75%酒精消毒30 s，静置90s，待孢子上下分层，去除上清液，用无菌水清洗3次，再用50ml的4% naclo溶液消毒，摇晃离心管4 min后静置分层，去除上清液，用无菌水清洗7次，再加入30 ml无菌水，制成无菌孢子悬浮液。
33.（2）桫椤孢子诱导配子体：将制成无菌孢子悬浮液接种于诱导配子体培养基上，在温度25
±
2℃、湿度80
±
2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月，得到桫椤孢子诱导配子体；诱导配子体培养基是由1/8ms+0.5mg/l的6-ba+0.1mg/l的2,4-d+20g/l蔗糖+16 g/l琼脂组成，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
34.1/8ms是由0.125份大量元素、1份铁盐、1份微量元素和1份有机物制成；大量元素是由1650mg/l硝酸铵+1900mg/l硝酸钾+440mg/l氯化钙+370mg/l硫酸镁+170mg/l磷酸二氢钾而制成；铁盐是由27.85mg/l硫酸亚铁+37.25mg/l乙二胺四乙酸二钠而制成；微量元素是由0.83mg/l碘化钾+6.2mg/l的硼酸+22.3mg/l硫酸锰+8.6mg/l硫酸锌+0.25mg/l钼酸钠+0.025mg/l硫酸铜+0.025mg/l氯化钴而制成；有机物是由100mg/l肌醇+0.5mg/l烟酸+0.5mg/l盐酸吡哆醇+0.1mg/l盐酸硫胺素+2mg/l甘氨酸而制成。（3）桫椤ggb的诱导增殖：将桫椤孢子诱导配子体切割成4
×
4mm的方块，接种的配子体的初始鲜重0.08-0.12g，接种在诱导增殖ggb培养基上，在温度25
±
2℃、湿度80
±
2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月，得到桫椤ggb；诱导增殖ggb培养基是由1/2ms+0.3 mg/l的6-ba+0.4 mg/l 的naa+30 g/l蔗糖+6 g/l的琼脂组成，再使用1 mol/l 的naoh和1 mol/l 的hcl调至ph值为5.80。
35.（4）桫椤ggb分化诱导：将桫椤ggb的诱导增殖体每隔15天，喷洒一次无菌水，促进c品受精，继续培养30天后，将c品分割为直径的1-1.5 cm的小球，接种到ggb分化诱导培养基中, 在温度25
±
2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养2个月后，桫椤ggb形成孢子体；ggb分化诱导培养基是由1/2ms+0.３mg/l 的kt+0.4 mg/l 的iba+30 g/l蔗糖+6 g/l琼脂组成，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
36.（5）桫椤孢子体生根诱导：取孢子体转接至生根诱导培养基诱导其生根，在温度25
±
2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 lux的培养条件下，培养1个月，得到桫椤再生植株；生根诱导培养基为：1/2ms+0.7 mg/l 的iaa+30 g/l蔗糖+6 g/l琼脂，再使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至ph为5.80。
37.（6）桫椤再生植株驯化、炼苗和移栽：选取苗高达到9 cm的桫椤再生植株在人工气候室驯化、练苗后移栽至红壤:黄壤:腐殖土=2:2:1的基质中，在温度25
±
2℃，湿度89
±
2%，
光质为白光，光周期16 h/d，培养1个月移栽到大棚进行常态化管理。
38.发明人为验证本发明的效果进行了以下实验：1实验例：1.1试药试剂（1）培养基：1/2ms、1/8ms。
39.大量元素：硝酸铵（nh4no3）、硝酸钾（kno3）、氯化钙（cacl2·
2h2o）、硫酸镁（mgso4·
7h2o）、磷酸二氢钾（kh2po4）。铁盐：硫酸亚铁（feso4·
7h2o）、乙二胺四乙酸二钠（na
2-edta
·
2h2o）；微量元素：由碘化钾（ki）、硼酸（h3bo3）、硫酸锰（mnso4
·
4h2o）、硫酸锌（znso4·
7h2o）、钼酸钠（na2moo4·
2h2o）、硫酸铜（cuso4·
5h2o）、氯化钴（cocl2·
6h2o。
40.有机物：肌醇、vb5烟酸、盐酸吡哆醇（维生素vb6）、盐酸硫胺素（维生素vb1）、甘氨酸。
41.（2）植物激素：6-苄氨基嘌呤（6-ba）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-d）、萘乙酸（naa）、6-糠基氨基嘌呤（kt）、吲哚丁酸（iba）、吲哚乙酸（iaa）。
42.（3）药品：氢氧化钠（naoh）、盐酸（hcl）、蔗糖、琼脂等。
43.仪器低速台式离心机、苏州净化超净工作台、上海博讯立式高压蒸汽灭菌锅、雷磁phs-3c台式酸度计、艾德姆衡器分析天平、4℃冰箱、移液枪等仪器。
44.培养基的配置：1/8ms培养基的配置：由0.125份大量元素、1份铁盐、1份微量元素和1份有机物制成。
45.按ms培养基中要求，大量元素母液使用无菌水配制成1650mg/l硝酸铵+1900mg/l硝酸钾+440mg/l氯化钙+370mg/l硫酸镁+170mg/l磷酸二氢钾的母液。铁盐使用无菌水配制成28.7mg/l硫酸亚铁+37.25mg/l乙二胺四乙酸二钠的母液。微量元素使用无菌水配制成0.83mg/l碘化钾+6.2mg/l硼酸+22.3mg/l硫酸锰+8.6mg/l硫酸锌+0.25mg/l钼酸钠+0.025mg/l硫酸铜+0.025mg/l氯化钴的母液。有机物使用无菌水配制成100mg/l肌醇+0.5mg/l烟酸+0.5mg/l盐酸吡哆醇+0.1mg/l盐酸硫胺素+2mg/l甘氨酸的母液。
46.1/2ms培养基的制备方法为常规方法即按培养基配方所述各组分及其含量混匀后ph计（雷磁phs-3c）测定溶液ph值，使用1 mol/l naoh和1 mol/l hcl调至5.8，倒入240 ml组培瓶中（每瓶约35 ml）。
47.组织培养过程：（1）桫椤无菌孢子的获取成熟的桫椤孢子用50 ml的离心管在蒸馏水浸泡12 h，离心机4500 r/min离心4 min，移液枪去除上清液。在超净工作台上用40 ml-50 ml 的75%酒精消毒30 s，静置1 min 30 s，待孢子上下分层，去除上清液，无菌水清洗3次；再用40 ml-50 ml的5% naclo溶液，并且摇晃离心管4 min后静置分层，去除上清液，无菌水清洗7-8次。最后加入20-30 ml无菌水制成无菌孢子悬浮液。
48.（2）桫椤孢子诱导配子体
用灭菌后的移液枪头吹打混匀无菌孢子悬浮液后吸取400 μl接种在表1的培养基上，每组接2皿，每皿400 μl，重复3次。培养条件为：温度：25
±
2℃，湿度：80
±
2%，光质：白光，光周期：12 h/d，光照强度为3000 lux。每10天观察一次，30后记录孢子诱导率。在olympus sz61解剖镜下任取10个视野记录观察配子体诱导数。孢子诱导率=（视野里诱导配子数/视野里总的孢子数）
×
100%。
49.（3）桫椤ggb的诱导增殖将步骤（2）成熟的配子体，切割成4
×
4 mm的方块，接种在表2诱导增殖ggb的培养基上。接种配子体初始鲜重约为0.102 g。每组接种5瓶，每瓶接种4个，重复3次。培养条件与（2）相同。培养时间2个月。2个月后统计ggb诱导率、增殖倍数。诱导率=（诱导的ggb数/接种配子体总数）
×
100%。增殖倍数=增殖后的鲜重/0.102 g。
50.（4）桫椤ggb分化将步骤（3）诱导增殖的ggb每隔15天，喷洒一次无菌水，促进ggb受精。继续培养30天后，分割成直径为1-1.5 cm的小球，接种在表3分化培养基上。培养条件与（2）相同，培养1个月诱导孢子体，统计其分化率。分化率=分化的ggb/接种的ggb总数）
×
100%。
51.（5）桫椤孢子体生根诱导将（4）中获得的孢子体继续接至表4生根培养基上。每组接种5瓶，每瓶接种3个，重复3次。培养1个月，培养条件与（2）相同。统计生根率。生根率=生根的孢子体数/接种的ggb总数）
×
100%。
52.（6）桫椤再生植株驯化、练苗及移栽将步骤（5）中桫椤高为5-10 cm再生植株在人工气候室驯化、练苗后移栽至表5不同基质中。每组移栽10株，重复3次。培养10-15天移栽到大棚。培养条件：温度25
±
2℃，湿度为89
±
2%，光质：白光，光照强度：3000 lux，光周期：16 h/d。15天后统计成活率。成活率=（成活桫椤苗/移栽总数）
×
100%。
53.生成配子体不同激素浓度组织培养试验：将桫椤的无菌悬浮液接种在l1-l8的培养基上，以观察到培养基表面有绿色小点即孢子开始诱导配子体，诱导情况（表1），对其结果用ibm spss statistics 27进行单因素方差分析（下同）。结果分析表明，各组间配子体诱导率、诱导天数均有显著差异（p＜0.05）。其中，配子体诱导率均高于40%，当6-ba浓度增高时，诱导率降低、诱导天数增加；其中l2的诱导率最高、诱导天数最短，并且与其他组合有显著差异。故1/8ms+6-ba（0.5 mg/l）+2,4-d（0.1 mg/l）+蔗糖20 g/l+琼脂10 g/l是桫椤孢子诱导配子体最适的组合。
54.表1不同浓度组合对桫椤孢子诱导配子体的影响
注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
55.的诱导增殖过程不同激素浓度组织培养试验：诱导成功的配子体接种于诱导ggb增殖培养基z1-z9上，其诱导率均为100%，无显著差异（p＞0.05），然而，各组间ggb鲜重、增殖倍数、直径均有显著差异（p＜0.05）。其中，z5组合ggb鲜重和增殖倍数最高、直径与z7和z9无显著差异，且ggb的松紧程度适中。故1/2ms+6-ba（0.3 mg/l）+naa（0.4 mg/l）+蔗糖30 g/l+琼脂10 g/l是配子体诱导ggb增殖最适的组合，见表2。
56.表2不同浓度组合对桫椤椤配子体诱导增殖ggb的影响注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05)。1.7 分化过程不同激素浓度组织培养试验：将增殖后的ggb切分接种至分化培养基h1-h12。结果分析表明，各组间分化率、分化芽叶数量均有显著差异（p＜0.05）。其随着kt的浓度增加，分化率降低、分化芽数量减少。其中h4的分化率最高并于其他组合有显著差异（p＜0.05）；分化芽数仅次于h5（46.00）。故1/2ms+kt（0.3 mg/l）+iba（0.4 mg/l）+蔗糖30 g/l+琼脂10 g/l是分化的最适组合，见表3。
57.表3不同浓度组合对桫椤ggb分化的影响
注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。1.8不同组合对桫椤孢子体生根诱导的影响试验：将分化后的桫椤孢子体接种于z1-z8生根诱导培养基中，其孢子体生根率、分化芽叶数、生根数量情况见表4。结果表明，孢子体的生根率为100%，各组间分化芽数量无显著差异（p＞0.05）；而诱导的生根数量差异显著（p＜0.05）。其中，z7的生根数最多，且其分化的茎叶数量为10，仅次于z5（10.33）。故1/2ms+iaa（0.7 mg/l）+蔗糖30 g/l+琼脂10 g/l是桫椤孢子体诱导生根的最适组合，见表4。
58.表4不同组合对桫椤孢子体生根诱导的影响
注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
59.桫椤移栽不同土壤基质影响试验：桫椤再生植株在人工气候室经驯化和练苗后，移栽至不同基质中。各组间的成活率无显著差异（p＞0.05），成活率均在90%以上。其中土壤基质红壤：腐殖土=1:1时，成活率可达100%，是适宜桫椤再生植株生长的基质。
60.表5不同土壤基质对桫椤孢子体（组培苗）移栽的影响注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
61.结论：本发明的一种桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法，该方法包括桫椤无菌孢子的获取、桫椤孢子诱导配子体、桫椤ggb诱导增殖、桫椤ggb分化、桫椤孢子体生根、桫椤再生植株驯化、练苗和移栽。已成功构建桫椤组织培养繁殖体系。由表面消毒后的无菌孢子在1/8ms+6-ba（0.5 mg/l）+2,4-d（0.1 mg/l）+蔗糖20 g/l+琼脂10 g/l成功诱导配子体，配子体诱导率为62%。配子体在1/2ms+6-ba（0.3 mg/l）+naa（0.4 mg/l）+蔗糖30 g/l+琼脂10 g/l成功诱导ggb增殖，诱导率达到100.00%，鲜重达到1.10mg，直径达到1.98cm，增殖倍数10.76。切分后的ggb在1/2ms+kt（0.3 mg/l）+iba（0.4 mg/l）+蔗糖30 g/l+琼脂10 g/l成功分化成孢子体，分化率达到92.13%。而孢子体在1/2ms+iaa（0.7 mg/l）+蔗糖30 g/l+琼脂10 g/l诱导其生根后生长发育为桫椤植株，生根率达到100%。桫椤植株驯化、练苗最后移栽到土壤基质红壤：腐殖土=1：1，此为最佳生长基质，成活率达到100%。本发明中ggb的
诱导率100%、ggb分化率92%、生根率100%、桫椤再生植株成活率100%。本发明成功扩繁了珍稀濒危植物桫椤，能够为产业化生产桫椤增添提供技术支持。