一种多肽毒素与化学农药的组合制剂及其制备方法和应用

本发明属于害虫防治，具体涉及一种多肽毒素与化学农药的组合制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、蜘蛛毒素是优秀的杀虫资源，具有良好的杀虫活性和很强的选择毒力。目前作用于昆虫鱼尼丁受体(ryanodine receptor)的蜘蛛毒素尚未见报道。鱼尼丁受体因其与鱼尼丁高度亲和而得名是控制细胞内ca2+释放的配体门控钙离子通道，主要位于肌肉细胞的肌质网和神经细胞的内质网上。以氯虫苯甲酰胺为代表的双酰胺类杀虫剂是昆虫鱼尼丁受体的变构调节剂，通过作用于靶标昆虫肌肉细胞的四聚体鱼尼丁受体，使受体变构与之结合而打开钙离子通道，细胞内的钙离子通过肌浆/内质网膜快速进入细胞质，引起害虫的肌肉持续收缩，继而出现麻痹和昏睡症状，并立即停食而最终死亡。自1998年第一个双酰胺类杀虫剂氟苯虫酰胺上市以来，该类杀虫剂以其独特的构效关系引起了广泛的研究兴趣，至今已先后有8个品种上市。尽管这类药剂中的氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺表现出对鳞翅目害虫优异的杀虫活性，但其抗药性问题也逐渐显现。2008年，菲律宾和泰国相继报道了小菜蛾对氯虫苯甲酰胺产生了775倍的抗性。

2、目前，在全球不同国家和地区，至少有9种鳞翅目害虫对氟苯虫酰胺或氯虫苯甲酰胺产生了不同水平的抗性。抗药性的产生严重威胁着氯虫苯甲酰胺等双酰胺类杀虫剂的使用寿命。而杀虫剂复配在提高害虫防治效果、延缓害虫抗药性方面具有投资少、收效快的优势。杀虫剂复配通常是将不同类型、不同作用方式的两种或两种以上的杀虫剂按照一定比例混合，以达到扩大防治范围、增强杀虫活性、提高防治效果、延缓和治理有害生物抗药性的目的。在鳞翅目害虫防治中的复配药剂，考虑到杀虫剂单剂的作用机制之间的差异性和互补性，主要包括有机磷与拟除虫菊酯两类杀虫剂之间的复配、有机磷与新烟碱两类杀虫剂之间的复配、双酰胺类与大环内酯两类杀虫剂之间的复配、双酰胺类与新烟碱两类杀虫剂之间的复配等，其他类型的复配仅有零星报道。对于生物大分子杀虫成分的研究，主要集中在单体杀虫活性、杀虫机制与应用示范等方面，还未见多肽类毒素与化学杀虫剂的复配测试与应用的报道。同时，由于需要避免作用于同一靶标的两个杀虫剂在靶标突变抗药性发展中的负面影响，因此还未见作用于同一靶标不同位点的杀虫剂复配方式。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种多肽毒素与化学农药的组合制剂，其主要成份是拟环纹豹蛛毒素pptx-22和氯虫苯甲酰胺。本发明提供的复配杀虫剂为多肽类毒素与化学杀虫剂的组合，可以高效用于主要农业害虫和卫生害虫的防治，解决害虫对化学杀虫剂抗药性发展迅速、化学杀虫剂过量使用、单一有效成分杀虫活性低等害虫防治中的问题。

2、本发明还提供所述组合制剂的制备方法和应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述的一种组合制剂，所述毒素生物制剂包括拟环纹豹蛛毒素pptx-22和氯虫苯甲酰胺，所述拟环纹豹蛛毒素pptx-22为一种成熟肽，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、

5、其中，所述拟环纹豹蛛毒素pptx-22和氯虫苯甲酰胺的摩尔比为1:5-5:1。

6、作为优选，所述拟环纹豹蛛毒素pptx-22和氯虫苯甲酰胺的摩尔比为1:5、1:3或者3:1。

7、本发明所述的组合制剂的制备方法，包括如下步骤：

8、(1)制备拟环纹豹蛛毒素pptx-22；

9、(2)将氯虫苯甲酰胺溶于二甲基亚砜，将拟环纹豹蛛毒素pptx-22溶于pbs缓冲液；将配制好的氯虫苯甲酰胺和pptx-22母液按比例混合，并稀释，配成一系列浓度梯度。

10、其中，步骤(1)中拟环纹豹蛛毒素pptx-22通过诱导表达纯化制备或者直接根据氨基酸序列人工合成。

11、其中，步骤(2)中拟将氯虫苯甲酰胺原药溶于二甲基亚砜，配成浓度为100mm的母液；将毒素pptx-22溶于ph＝7.4的pbs缓冲液，配成浓度为10mm的母液；将配制好的氯虫苯甲酰胺和pptx-22母液按照一系列比例混合，并用ph＝7.4的pbs稀释，配成一系列浓度梯度。

12、本发明所述的组合制剂在农业害虫和卫生害虫防治中的应用。

13、作为优选，所述农业害虫和卫生害虫包括粘虫、草地贪夜蛾、小菜蛾、二化螟、甜菜夜蛾、稻纵卷叶螟、茶尺蠖、桃小食心虫、玉米螟、小地老虎。

14、其中，所述组合制剂防治农作物害虫的通过喷雾植物叶片和/或害虫体表。

15、本发明所述拟环纹豹蛛毒素pptx-22和氯虫苯甲酰胺在制备对农业害虫和卫生害虫具有显著增效作用的毒素-杀虫剂组合制剂中的应用。

16、本发明提供的组合制剂用于主要农业害虫和卫生害虫的防治。其中害虫的例子包括但不限于：粘虫、草地贪夜蛾、小菜蛾、二化螟、甜菜夜蛾、稻纵卷叶螟、茶尺蠖、桃小食心虫、玉米螟、小地老虎等。

17、作用机理：本发明通过电生理实验对拟环纹豹蛛毒素pptx-22与氯虫苯甲酰胺联合作用的机制进行了研究。结果表明，pptx-22能够诱发粘虫神经细胞内钙离子浓度升高，且用cdcl2阻断细胞膜上的钙通道，不能阻止细胞内钙离子浓度升高的趋势，说明pptx-22不作用于细胞膜上的钙通道(图1)。用2-apb阻断粘虫神经细胞内质网上的ip3r钙离子通道，不能影响pptx-22引起的细胞内钙离子浓度升高的趋势，说明pptx-22不作用于内质网上的ip3r受体(图2)。用高浓度鱼尼丁阻断粘虫神经细胞内质网上的鱼尼丁受体，几乎完全抑制了pptx-22引起的细胞内钙离子浓度升高，说明pptx-22作用于内质网上的鱼尼丁受体(图3)。

18、本发明进一步分析了毒素pptx-22与氯虫苯甲酰胺是否作用于昆虫鱼尼丁受体上的相同作用位点。图4的结果表明，用pptx-22进行预处理，然后再添加氯虫苯甲酰胺时，先添加的pptx-22对后续添加的氯虫苯甲酰胺引发的粘虫神经细胞钙离子浓度升高存在影响，但却不能完全抑制。反之依然，用氯虫苯甲酰胺进行预处理，然后再添加pptx-22时，先添加的氯虫苯甲酰胺对后续添加的pptx-22引发的粘虫神经细胞钙离子浓度升高同样存在影响，但却不能完全抑制。这说明pptx-22和氯虫苯甲酰胺在昆虫鱼尼丁受体上的作用位点存在交叉但不重叠，在靶标层面形成增效。

19、本发明还通过电生理实验研究了以不同比例混合的pptx-22和氯虫苯甲酰胺对粘虫神经细胞的活性。图5的结果表明，当混合物总浓度为6.5μm，pptx-22和氯虫苯甲酰胺不同配比对粘虫神经细胞钙离子浓度升高具有不同的活性，一些配比具有明显的增加作用(图中不同小写字母表示0.05水平的显著差异)。图6的结果表明，当混合物中pptx-22和氯虫苯甲酰胺的比例为1:5、1:3和3:1时，组合对粘虫神经细胞活性的抑制中浓度(ec50)显著低于单独使用用毒素pptx-22(即1:0)和单独使用氯虫苯甲酰胺(即0:1)时的ec50(图中不同小写字母表示0.05水平的显著差异)。综合以上结果，本发明提出的毒素pptx-22和氯虫苯甲酰胺的组合在最佳配比时，对其作用靶标的生物活性显著高于两种单剂。

20、本发明通过分析作用于昆虫钠离子通道的蜘蛛毒素pptx-22与拟除虫菊酯杀虫剂氯虫苯甲酰胺作用机制的异同点，并测试蜘蛛毒素与菊酯类杀虫剂联合作用的机制发现，毒素pptx-22的作用位点特异，与氯虫苯甲酰胺协同调控昆虫钠离子通道，在靶标层面形成增效，并据此获得了对农业害虫增效的毒素-杀虫剂组合制剂。本发明不仅高效利用毒素pptx-22，同时发现pptx-22和氯虫苯甲酰胺作用于同一个靶标但作用位点不同，首次利用了同一个靶标杀虫剂复配，一般两个化学杀虫剂复配需要避免作用于同一个靶标，两个化学杀虫剂或者农药作用于同一个位点且同时使用时，不同时发挥两者的作用，因为没有机会攻击位点，位点被高毒力农药占据了，低毒力的显示不出毒力。而本发明提供的多肽毒素与化学农药虽然作用于同一个靶标，但是位点不同，所以两个成分可以同时攻击位点，不会互相干扰；而且同时攻击造成效果叠加，形成增效。

21、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

22、(1)本发明首次发现了作用于昆虫鱼尼丁受体的蜘蛛毒素pptx-22，其与氯虫苯甲酰胺协同调控昆虫鱼尼丁受体，在靶标层面形成增效，并据此提供了一种对害虫具有显著增效作用的毒素-杀虫剂组合制剂。该组合制剂对害虫的防治效果显著优于两种单剂的防治效果，减少了杀虫剂的使用量，降低了多种农业害虫、卫生害虫的防治成本，对于害虫抗性防治具有重要作用。

23、(2)本发明组合制剂由多肽类毒素与化学杀虫剂的复配，作用于同一靶标的杀虫剂复配方式，其致死中浓度(lc50)均显著低于pptx-22和氯虫苯甲酰胺两种单剂，且复配的共毒系数为194～281(超过120即为增效)。

24、(3)本发明的组合制剂其制备简单，使用方便，对植物、人体和环境的危害性小，可以广泛使用在田间。