一种以海绵为支撑物的红薯脱毒组培苗液体培养方法与流程

1.本发明属于农业种植技术领域，具体涉及一种以海绵为支撑物的红薯脱毒组培苗液体培养方法。


背景技术：

2.红薯是我国四大粮食作物之一，常年种植面积7-8千万亩，产量超亿吨，占全世界种植面积的60％，产量的80％。由于红薯有长寿食品和抗癌食品的美誉，人们对优质红薯的需求越来越大，农民种植效益也越来越好。
3.红薯是旋花科一年或多年生植物，主要通过无性繁殖进行世代交替，红薯生长过程中会遭受10多种病毒感染，导致产量和品质逐年下降，导致品种严重退化。通过剥取红薯品种的生长点进行组织培养，能够获得没有受到病毒侵染的植株，实现品种的提纯复壮目标。因此培养茎尖分生组织并大量繁殖出脱毒苗成为目前生产脱毒红薯种苗最好的方法。
4.红薯脱毒首先从茎尖生长点将剥出未受病毒侵染的分生细胞进行培养，等到生长成试管组培苗时，提取红薯的全rna，用pcr方法进行病毒检测，挑选经过鉴定不含有病毒的组培苗进行快繁，之后进行组培苗的生根培养，再将生根组培苗放入温室定植到基质中进行驯化，最后的经过驯化的穴盘苗销售给繁苗专业户进行脱毒红薯苗的生产。
5.目前脱毒红薯组培苗的快繁及生根培养采用的是含有琼脂的增殖培养基和生根培养基，以琼脂形成的固体培养基作为植株的支撑进行微扦插繁殖或生根，也就是将试管苗切成带有1-2片叶的茎段直接插入培养基中，培养基中的养分供植株生长或生根，待植株生长到10cm左右，再重复进行微扦插，从而实现快速增殖或生根的目的。
6.但上述方法存在有两个问题：1、琼脂成本高，占整个培养基成本的60％；2、采用微扦插方法进行快繁时，将取出上面茎段进行微扦插后，由于固体培养基(琼脂培养基)植株根系周围的营养基本耗尽，老苗(老根)很难再发新芽，因此被淘汰，繁殖系数相对较低；3、生根苗驯化定植到基质时还需要把琼脂培养基洗掉，才能将苗种植到基质里进行驯化，否则培养基会引起霉菌滋生导致组培苗死亡，因此，这一驯化步骤耗费的人工较大。
7.基于此，有必要提出一种新的红薯脱毒组培苗液体培养方法。


技术实现要素：

8.本发明要解决的技术问题是提供一种以海绵为支撑物的红薯脱毒组培苗液体培养方法，降低培养基成本，减少生产过程，提高组培繁殖系数和生产效率。
9.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：该以海绵为支撑物的红薯脱毒组培苗液体培养方法，包括有以下步骤：
10.s1海绵加工：将海绵加工成海绵方块，在所述海绵方块的中间形成与红薯脱毒组培苗茎段直径相匹配的孔洞；
11.s2红薯脱毒组培苗液体微扦插培养：进行红薯脱毒组培苗微扦插时，将红薯脱毒组培苗茎段插入海绵方块中，倒入液体增殖营养液或生根营养液，进行增殖培养或生根培
养。
12.本发明通过以打孔海绵为支撑物进行脱毒红薯组培苗营养液增殖培养和生根培养，大幅度降低了培养基成本，减少了生产过程，提高了组培繁殖系数和生产效率；海绵具有吸水、保湿、透气功能，利用海绵作为支撑物进行组培苗微扦插增殖和生根培养，能够不间断给组培苗提供所需的养分、水分和空气，不仅替代了琼脂固体培养基的支撑作用，而且能够进行营养液的补充，实现了老苗的持续培养，提高了繁殖系数；采用营养液进行微扦插液体培养节省了琼脂的使用，大幅度降低了培养基的成本，同时由于营养液的流动性好，营养液中的ms浓度减少一半可以取得同样的培养效果，因此培养基综合成本测算(将能源、人工计入)减少了65％以上；采用液体培养省略了琼脂溶解的操作流程，不仅提高了工作效率，而且使得营养更加均匀一致，营养成分充分流动使得红薯脱毒组培苗更容易充分吸收到养分，生长更好，培养基的使用量也相应减少。
13.优选的，在所述步骤s2中，进行微扦插增殖培养，当红薯组培苗长成约10cm高，5-6个叶片时，按1-2叶片/茎段切下，茎段长度1.5-2cm长，再插到4-5个新的海绵方块的孔中进行增殖培养；
14.老苗的培养瓶中再加入新的液体增殖营养液，获得新的营养液后老苗即可重新生长繁殖。
15.优选的，在所述步骤s2中，进行微扦插增殖培养时，包括以下步骤：
16.s2-1：所述液体增殖营养液包括有1/2ms、6-ba0.1mg/l和3％蔗糖，ph值5.8，不加琼脂粉；30ml液体增殖营养液加入培养瓶内，再将所述步骤s1中的打孔海绵方块放入培养瓶内，每瓶放6-8个，高温灭菌后进行接苗；
17.s2-2：接种，将红薯脱毒组培苗茎段切成1-3cm长度，并带有1-2张叶片的茎段插入海绵方块孔中即可，每瓶可插6-8株；
18.s2-3：培养条件，温度24-26度，光照2000lx，光照时间14h/d；培养周期，30d，待植株生长成10cm高及5-6个叶片以上，可以重复进行微扦插培养；
19.s2-4：微扦插，重复步骤s2-2，将植株切成1-3cm长度，并带有1-2张叶片的茎段，重新插入海绵方块孔中，放入液体增殖营养液的培养瓶中进行增殖培养；
20.s2-5：老苗再增殖培养，在原来母苗的培养瓶中再添加入新的液体增殖营养液，即可重新生长进行增殖培养。
21.采用上述技术方案，脱毒红薯组培苗的繁殖系数可以增加20％以上。
22.优选的，在所述步骤s2中，进行红薯脱毒组培微扦插苗的生根培养，培养瓶内更换液体生根营养液即变成生根培养，待脱毒红薯组培苗生根后，将生根苗连带海绵方块一起取出，直接植入基质中即可，待1周的保温保湿避光驯化培养后，组培苗在基质里生长出新根后即成活，待2-3周生长后，脱毒红薯组培驯化苗就可作为原种出售。
23.由于采用海绵为支撑物，不需要清洗组培苗根系所带的固体培养基，直接清水(500倍多菌灵溶液)漂洗后放入基质即可完成驯化操作，操作工从每天每人驯化2000株产量提高到2600株，效率提高25％以上；由于海绵具有保湿透气的功能，组培生根苗驯化时的成活率有了一定的提高，海绵方块不影响红薯苗以后的生长。
24.优选的，在所述步骤s2中，进行微扦插生根培养时，包括以下步骤：
25.s2-1：所述液体生根营养液包括有1/2ms和3％蔗糖，ph值5.8，不加琼脂粉；30ml液
体生根营养液加入培养瓶内，再将所述步骤s1中的打孔海绵方块放入培养瓶内，每瓶放8-10个，高温灭菌后进行接苗；
26.s2-2：接种，将切下的红薯脱毒组培苗茎段插入海绵方块孔中即可，每瓶可插8-10株；
27.s2-3：培养条件，温度26-28度，光照3000lx，光照时间12/d；培养周期，20-25d，待根系长出海绵方块时皆可进行驯化；
28.s2-4：老苗生根培养，母苗增殖微扦插培养后，在的培养瓶中更换成液体生根营养液，即可进行生根培养，利用老苗生根，增加了生根苗的数量。
29.优选的，所述步骤s2-3中，生根苗的驯化成苗具体包括以下步骤：
30.(1)采用50孔穴盘，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡30分钟备用；
31.(2)准备好驯化基质：将草炭与珍珠岩按3:1体积比混合，装入穴盘；
32.(3)将生根组培苗在稀释500倍的多菌灵溶液中漂洗一次，然后将带组培苗的海绵方块栽入基质中；
33.(4)搭小拱棚，盖上薄膜和遮阳网；
34.(5)温度控制在20-30℃第四天开始逐步通风和见光；一周后可以掀掉薄膜正常管理。
35.由于气候等生态环境的变化以及土地高强度复种的状态下，农作物的病虫害日趋严重，红薯脱毒组培苗由于其去除的病毒危害，达到了品种提纯复壮的目的，因而显示出很好的抗病性和高产优质的性状，因此市场对组培苗的需求也是日益扩大。本发明通过组培方法的改进，可以大幅度提高脱毒组培的生产效率和降低成本，为脱毒苗的进一步的产业化提供了技术基础；本发明不仅可以用于红薯脱毒组培苗的生产，同样可以被其他组培苗微扦插繁殖和组培苗生根的作物借鉴。
36.本发明有如下优点：1、大幅度降低成本：除了增加海绵的成本外(每株苗0.002元)，可以减少培养基成本80％，人工成本25％，总体成本下降65％以上(计入能源和人工)，大约每株苗0.07元；2、提高效率：减掉了琼脂溶解的操作，提高了接种和生根驯化的效率；3、大幅度提高的增殖苗和生根苗的产量：由于老苗可以添加营养液在培养，无论增殖苗还是生根苗的产量可以提高20％以上。因此，本发明的推广运用对红薯脱毒组培苗的产业化将是一个巨大的推动。
附图说明
37.图1为本发明以海绵为支撑物的红薯脱毒组培苗液体培养方法中的海绵结构示意图；
38.图2为本发明以海绵为支撑物的红薯脱毒组培苗液体培养方法中的脱毒红薯组培苗进行生根培养结构示意图。
具体实施方式
39.下面结合附图对本发明实施例进行详细描述，以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
40.本发明实施例中的以海绵为支撑物的红薯脱毒组培苗液体培养方法，包括有以下
步骤：
41.s1海绵加工：将海绵加工成海绵方块，在所述海绵方块的中间形成与红薯脱毒组培苗茎段直径相匹配的孔洞，如图1所示，1cm见方的海绵方块，中间打一个2mm的孔；
42.s2红薯脱毒组培苗液体微扦插培养：进行红薯脱毒组培苗微扦插时，将红薯脱毒组培苗茎段插入海绵方块中，倒入液体增殖营养液或生根营养液，进行增殖培养或生根培养。
43.在所述步骤s2中，进行微扦插增殖培养，当红薯组培苗长成约10cm高，5-6个叶片时，按1-2叶片/茎段切下，茎段长度1.5-2cm长，再插到4-5个新的海绵方块孔中进行增殖培养；
44.老苗的培养瓶中再加入新的液体增殖营养液，获得新的营养液后老苗即可重新生长繁殖。
45.在所述步骤s2中，进行微扦插增殖培养时，包括以下步骤：
46.s2-1：所述液体增殖营养液包括有1/2ms、6-ba 0.1mg/l和3％蔗糖，ph值5.8，不加琼脂粉；30ml液体增殖营养液加入培养瓶内，再将所述步骤s1中的打孔海绵方块放入培养瓶内，每瓶放6-8个，高温灭菌后进行接苗；
47.s2-2：接种，将红薯脱毒组培苗茎段切成1-3cm长度，并带有1-2张叶片的茎段插入海绵方块孔中即可，每瓶可插6-8株；
48.s2-3：培养条件，温度24-26度，光照2000lx，光照时间14h/d；培养周期，30d，待植株生长成10cm高及5-6个叶片以上，可以重复进行微扦插培养；
49.s2-4：微扦插，重复步骤s2-2，将植株切成1-3cm长度，并带有1-2张叶片的茎段，重新插入海绵孔中，放入液体增殖营养液的培养瓶中进行增殖培养；
50.s2-5：老苗再增殖培养，在原来母苗的培养瓶中再添加入新的液体增殖营养液，即可重新生长进行增殖培养。
51.此外，在所述步骤s2中，如图2所示，红薯脱毒组培微扦插苗的生根培养，培养瓶内的更换成液体生根营养液即变成生根培养，待脱毒红薯组培苗生根后，将生根苗连带海绵方块一起取出，直接植入基质中即可，待1周的保温保湿避光驯化培养后，组培苗在基质里生长出新根后即成活，待2-3周生长后，脱毒红薯组培驯化苗就可作为原种出售；
52.在所述步骤s2中，进行微扦插生根培养时，包括以下步骤：
53.s2-1：所述液体生根营养液包括有1/2ms和3％蔗糖，ph值5.8，不加琼脂粉；30ml液体生根营养液加入培养瓶内，再将所述步骤s1中的打孔海绵方块放入培养瓶内，每瓶放8-10个，高温灭菌后进行接苗；
54.s2-2：接种，将切下的红薯脱毒组培苗茎段插入海绵方块孔中即可，每瓶可插8-10株；
55.s2-3：培养条件，温度26-28度，光照3000lx，光照时间12h/d；培养周期，20-25d，待根系长出海绵方块时皆可进行驯化；
56.s2-4：老苗生根培养，母苗增殖微扦插培养后，在的培养瓶中更换成液体生根营养液，即可进行生根培养，利用老苗生根，增加了生根苗的数量。
57.所述步骤s2-3中，生根苗的驯化成苗具体包括以下步骤：
58.(1)采用50孔穴盘，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡30分钟备用；
59.(2)准备好驯化基质：将草炭与珍珠岩按3:1体积比混合，装入穴盘；
60.(3)将生根组培苗在稀释500倍的多菌灵溶液中漂洗一次，然后将带组培苗的海绵方块栽入基质中；
61.(4)搭小拱棚，盖上薄膜和遮阳网；
62.(5)温度控制在20-30℃第四天开始逐步通风和见光；一周后可以掀掉薄膜正常管理。
63.本实施例的以海绵为支撑物的红薯脱毒组培苗液体培养方法，因为采用了液体培养，节省了琼脂的使用，成本降低了60％，简化了培养基制备的流程；由于液体培养基的流动性好，养分能够充分被吸收，因此加入培养液的量可以节省30％，而培养液的浓度还可以降低50％(与固体培养基相比)。
64.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。