小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病短片段易位系的创制方法及其应用

1.本发明属于小麦遗传育种领域，具体涉及小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病短片段易位系的创制方法及其应用。


背景技术：

2.小麦是全球重要粮食作物之一。然而，目前小麦产量的增长速度难以满足未来全球人口增长的需求。应对这一挑战的一项关键措施是提高小麦对各种病害的抗性，这样可以挽回每年因病害导致的15-20％的产量损失。茎基腐病是小麦真菌病害的一种，近年来在我国黄淮麦区呈逐年加重趋势，已成为严重威胁小麦生产的重要病害，2022年被列为我国10个产业技术问题之一。
3.研究表明，培育和种植抗病品种是解决小麦茎基腐病问题最经济有效的措施。然而，目前生产上可以利用的有效抗源却很少，来自长穗偃麦草的fhb7是目前唯一的一个已知的主效抗病基因，利用生物技术的方法，可以将该基因转移到推广小麦品种中，培育出抗病新品种。本实验室已利用中国春ph1b突变体诱导部分同源染色体联会重组，创制了携带fhb7的第一代小麦-长穗偃麦草易位系sdau2028(t7ds.7dl-7el2l)，外源染色体占易位染色体的比例为16.1％。但是，由于fhb7与八氢番茄红素合成酶基因psy-e2(可催化合成黄色素)紧密连锁，相距仅18mb，所创制的小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病易位系如sdau2028等面粉呈黄色，影响了其面粉及其制品的传统商品性。消费市场对面粉色泽多样化的需求,导致小麦育种目标不同，为了使fhb7在生产上更好地推广应用，打破fhb7与psy-e2的连锁，创制只携带fhb7的小麦-长穗偃麦草短片段易位系具有重要意义。


技术实现要素：

4.针对现有进展存在的上述问题，本发明以携带fhb7的第一代小麦-长穗偃麦草易位系sdau2028(t7ds.7dl-7el2l)作为供体亲本，通过cs ph1b突变体诱导7d和7el2部分同源区之间的减数分裂重组，打破fhb7与psy-e2的连锁，利用分子标记与基因组原位杂交技术，同时结合茎基腐病抗性鉴定进行验证，创制了小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病短片段易位系山农2-16和山农16-1；并以山农2-16为fhb7的供体亲本，将fhb7转移至我国主栽小麦品种孟麦023中，创制出携带fhb7的改良株系，茎基腐病抗性鉴定结果表明，改良株系的茎基腐病抗性显著提高，这说明源于十倍体长穗偃麦草抗茎基腐病基因fhb7的抗性强并且能够稳定遗传，可以用于小麦抗茎基腐病育种应用。本发明创制的小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病短片段易位系，为从源头上解决我国小麦抗茎基腐病难题提供了有效抗源。
5.本发明公开了一种小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病短片段易位系的创制方法，其特征在于步骤如下：
6.(1)以携带fhb7的小麦-长穗偃麦草短片段易位系sdau2028为父本，以中国春ph1b突变体(cs ph1b)为母本，杂交获得f1；
7.(2)f1与cs ph1b回交，从bc1f1代植株中提取基因组dna，利用ph1b基因的特异分子标记xpsr128、xpsr574和xawjl3以及与fhb7紧密连锁的7el2特异分子标记xcfa2240和xsdauk66进行检测；筛选到ph1b基因纯合而fhb7基因杂合的单株，这些单株自交后获得若干bc1f2代植株并全部提取基因组dna；
8.(3)利用上述与fhb7紧密连锁的7el2特异分子标记xcfa2240以及psy-e2的功能标记k-psy对bc1f2代植株进行基因分型，筛选携带长穗偃麦草抗茎基腐病基因fhb7而不含黄色素基因psy-e2的小麦-长穗偃麦草短片段易位系，自交纯合；
9.(4)pcr扩增反应产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳以及琼脂糖凝胶电泳分析纯合体的基因型；
10.(5)进行荧光原位杂交鉴定。
11.上述步骤(2)中所述分子标记如下：
12.xpsr128，正向引物p1，序列为seq id no.1；反向引物p2，序列为seq id no.2；
13.xpsr574，正向引物p3，序列为seq id no.3；反向引物p4，序列为seq id no.4；
14.xawjl3，正向引物p5，序列为seq id no.5；反向引物p6，序列为seq id no.6；
15.xcfa2240，正向引物p7，序列为seq id no.7；反向引物p8，序列为seq id no.8；
16.xsdauk66，正向引物p9，序列为seq id no.9；反向引物p10，序列为seq id no.10；
17.上述步骤(3)中所述分子标记如下：
18.k-psy，正向引物p11，序列为seq id no.11；反向引物p12，序列为seq id no.12。
19.本发明提供的方法创制的含有小麦抗茎基腐病基因fhb7的小麦-长穗偃麦草短片段易位系可在小麦抗茎基腐病育种中应用。
20.本发明提供了小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病短片段易位系中与小麦抗茎基腐病基因fhb7紧密连锁的分子标记k-7396，其正向引物核苷酸序列如seq id no.13所示；其反向引物的核苷酸序列如seq id no.14所示。
21.小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病短片段易位系中与小麦抗茎基腐病基因fhb7紧密连锁的分子标记k-7396可在小麦抗茎基腐病育种中应用。
22.分子标记k-7396也可检测目标株系中是否携带fhb7。
23.本发明提供了一种携带小麦抗茎基腐病基因fhb7的遗传改良系的创制方法，其特征在于：以创制的小麦-长穗偃麦草短片段易位系为fhb7的供体亲本，以我国主栽小麦品种为轮回亲本，连续回交2次后自交6次，并利用权利要求4所述的与fhb7紧密连锁的分子标记k-7396进行辅助选择鉴定，保留携带fhb7的单株；获得了遗传改良系。
24.本发明提供的遗传改良系可在小麦抗茎基腐病育种中应用。
25.本发明提供的方法创制了携带fhb7的小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病短片易位系山农2-16和山农16-1，并公开了其在小麦抗茎基腐病育种中的应用；
26.本发明的发明人还提供了一个与小麦抗茎基腐病基因fhb7紧密连锁的分子标记k-7396，其正向引物核苷酸序列如seq id no.13所示；其反向引物的核苷酸序列如seq id no.14所示。利用该分子标记可以检测目标株系中是否携带fhb7。
27.本发明还提供了我国主栽小麦品种孟麦023背景下，携带fhb7的抗茎基腐病改良株系山农0601、山农00602、山农0603、山农0604、山农0605、和山农0606及其在小麦抗茎基腐病育种中的应用。
28.本发明的有益效果主要在于：利用染色体工程的方法，结合分子标记辅助选择、原位杂交鉴定技术和茎基腐病抗性鉴定，打破了fhb7与psy-e2的连锁，创制了携带fhb7的小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病短片段易位系山农2-16和山农16-1，它们不仅保持了稳定的茎基腐病抗性，而且面粉色泽呈现白色，可以更好地在生产上推广应用。利用山农2-16与我国主栽小麦品种孟麦023进行杂交、回交和自交，结合分子标记辅助选择、人工气候室加代和茎基腐病抗性鉴定等技术创制了一批携带fhb7的抗茎基腐病改良材料，结果表明，与亲本孟麦023相比，携带fhb7的改良株系的茎基腐病抗性显著提高，这说明源于十倍体长穗偃麦草抗茎基腐病基因fhb7的抗性强并且能够稳定遗传，可以用于小麦抗茎基腐病育种应用。本发明创制的小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病短片段易位系，为从源头上解决我国小麦抗茎基腐病“卡脖子”难题提供了有效抗源。
附图说明
29.图1图示分子标记xcfa2240和k-psy在小麦-长穗偃麦草短片段易位系bc1f2代群体样品中的电泳检测结果。泳道1-15分别代表bc1f2代的不同单株，其中泳道7和13为潜在的打破fhb7与psy-e2连锁的基因型。
30.图2图示小麦-长穗偃麦草短片段易位系的荧光原位杂交鉴定结果。
31.图3图示小麦-长穗偃麦草短片段易位系的茎基腐病抗性鉴定。
32.图4图示小麦-长穗偃麦草短片段易位系的面粉色泽鉴定。
具体实施方式
33.实施例1小麦-长穗偃麦草短片段易位系的分子创制
34.(1)以携带fhb7的小麦-长穗偃麦草短片段易位系sdau2028为父本，以中国春ph1b突变体(cs ph1b)为母本，杂交获得f1。
35.(2)f1与cs ph1b回交，从1023株bc1f1代植株中提取基因组dna，利用ph1b基因的特异分子标记xpsr128(正向引物p1：(seqidno.1)和反向引物p2:(seqidno.2))，xpsr574(正向引物p3：(seqidno.3)和反向引物p4：(seqidno.4))和xawjl3(正向引物p5：(seqidno.5)和反向引物p6：(seqidno.6))以及与fhb7紧密连锁的7el2特异分子标记xcfa2240(正向引物p7:(seqidno.7)和反向引物p8:(seqidno.8))和xsdauk66(正向引物p9：(seqidno.9)和反向引物p10：(seqidno.10))进行检测，筛选到216株ph1b基因纯合而fhb7基因杂合的单株，这些单株自交后获得21000株bc1f2代植株并全部提取基因组dna。
36.(3)利用上述与fhb7紧密连锁的7el2特异分子标记xcfa2240以及psy-e2的功能标记k-psy(正向引物p11：(seqidno.11)和反向引物p12：(seqidno.12))对21000株bc1f2代植株进行基因分型，目的是获得分子标记xcfa2240携带十倍体长穗偃麦草基因型,而分子标记k-psy携带小麦基因型的株系(图1)，最终获得了两个潜在的携带长穗偃麦草抗茎基腐病基因fhb7的小麦-长穗偃麦草短片段易位系(表1，类型1)，自交纯合后命名为山农2-16和山农16-1。荧光原位杂交结果证实，与sdau2028相比，山农2-16和山农16-1中的7el2片段确实明显减少(图2)。
37.表1 21000株bc1f2代植株进行基因分型
[0038][0039]a分子标记单体型：w代表仅含有小麦的基因位点；t代表十倍体长穗偃麦草和小麦染色体杂合的基因位点
[0040]
(4)在pcr扩增反应体系中，pcr试剂组成为：1μldna模板，7.5μl2
×
taq master mix，前后引物各1.0μl，4.5μl h2o。
[0041]
pcr扩增程序为95℃预变性5min；然后94℃变性50s，55℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。pcr扩增反应完成后，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶中上样电泳，用银染法染色检测。电泳结束后用alphainnotechv.1.2型凝胶成像系统照相，记录每个样品的基因型。
[0042]
(5)荧光原位杂交鉴定：挑选饱满的种子置于垫有双层湿滤纸的培养皿中23℃萌发，露白后在4℃条件下作同步化处理24h，然后转入23℃恒温培养24h，剪取长度适宜的根尖进行有丝分裂中期染色体的制备，以十倍体长穗偃麦草特异序列为探针进行检测。用olympus bx53荧光显微镜观察染色体，使用spot ccd dp72捕获图像，并使用photoshop进行处理。
[0043]
实施例2小麦-长穗偃麦草短片段易位系的表型鉴定
[0044]
(1)分别于2019和2020年在山东农业大学的人工气候室中对创制的小麦-长穗偃麦草短片段易位系进行了茎基腐病抗性鉴定。室内环境为25℃，16h光照，20℃，8h黑暗，相对湿度为60％-80％。当幼苗长到3cm左右时，用假禾谷镰刀菌侵染的病麦粒对其进行接种，每个材料接种10株大小一致的幼苗，每棵幼苗周围的土壤表面均匀放置3粒病麦粒。于25天后统计发病情况，按照严重程度分为9级，具体分级为：
[0045]
0级，未发病；
[0046]
1级，第一叶片黄化，第一叶鞘出现轻度症状，褐化但小于1/2；
[0047]
2级第一叶鞘发病严重，第一叶鞘黑化程度褐化大于1/2,第一片叶片黄化严重但没有枯死；
[0048]
3级，第一片叶及第一叶鞘均褐枯至死，第二片叶出现黄化，第二叶鞘出现轻度症状，但褐化面积小于1/2；
[0049]
4级，第二叶片明显褐枯，枯死斑小于1/2，第二叶鞘出现明显症状，褐化面积大于1/2；
[0050]
5级，第二片叶褐化严重，枯死斑大于1/2，但未完全枯死，第三叶鞘轻度发病；
[0051]
6级，第二片叶及第二叶鞘均褐枯至死，第三片叶出现黄化；
[0052]
7级，第三片叶明显褐化，枯死斑小于1/2，第三叶鞘明显发病，出现褐色条纹至黑化，但不超过1/2；
[0053]
8级，第三片叶及第三叶鞘发病严重至植株接近死亡。
[0054]
每一分级有相应的病级代表值，0＝0％，1＝12.5％，2＝25％，3＝37.5％，4＝
50％，5＝62.5％，6＝75％，7＝87.5％，8＝100％。
[0055]
病情指数(disease index，di)＝σ(病级株树*各病级代表值)/(总株数*最高级代表值)*100
[0056]
利用统计软件spss 18.0对获得的数据进行统计分析，处理间的差异是用duncan检验法来表示的。
[0057]
(2)茎基腐病抗性鉴定结果表明，在接种25天后，携带fhb7的山农2-16和山农16-1的大多数植株仅在第一叶鞘出现褐色病变，其他叶鞘、叶片和根正常生长，展现出良好的茎基腐病抗性(图3)。与抗病亲本sdau2028相似，山农2-16和山农16-1的di显著低于感病亲本cs ph1b(表2)。该结果表明，山农2-16仍然保持着与第一代短片段易位系sdau 2028相同水平的茎基腐病抗性。
[0058]
表2小麦-长穗偃麦草短片段易位系的茎基腐病抗性鉴定
[0059][0060]
注：一列中表型值后的不同小写字母表明在p＜0.05时存在显著差异
[0061]
(3)将小麦-长穗偃麦草短片段易位系的种子收获后磨成面粉，可以看出山农2-16和山农16-1的面粉色泽为白色，与cs ph1b相似，而sdau 2028的面粉色泽为黄色(图4)。
[0062]
(4)综上所述，新创制的小麦-长穗偃麦草短片段易位系山农2-16和山农16-1不仅保持了稳定的茎基腐病抗性，而且面粉色泽变为白色，成功解决了连锁累赘问题。
[0063]
实施例3小麦-长穗偃麦草短片段易位系中fhb7的转移利用
[0064]
(1)以创制的小麦-长穗偃麦草短片段易位系山农2-16为fhb7的供体亲本，以我国主栽小麦品种孟麦023为轮回亲本，连续回交2次后自交6次，并利用新开发的与fhb7紧密连锁的分子标记k-7396(正向引物p13：(seq id no.13)和反向引物p14：(seq id no.14))进行辅助选择鉴定，保留携带fhb7的单株。获得了孟麦023背景下的6个遗传改良系，分别命名为山农0601、山农00602、山农0603、山农0604、山农0605、和山农0606。
[0065]
(2)在pcr扩增反应体系中，pcr试剂组成为：1μl dna模板，7.5μl 2
×
green taq mix，前后引物各1.0μl，4.5μl h2o。
[0066]
pcr扩增程序为95℃预变性5min；然后94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。pcr扩增反应完成后，扩增产物在1％琼脂糖凝胶中上样电泳，电泳结束后用alphainnotechv.1.2型凝胶成像系统照相，记录每个样品的基因型。
[0067]
(3)分别于2021和2022年在山东农业大学的人工气候室中对孟麦023背景下的6个遗传改良系进行了茎基腐病抗性鉴定。鉴定方法在实例2中已作详细说明，在此不再赘述。利用统计软件spss 18.0对获得的数据进行统计分析，处理间的差异是用duncan检验法来
表示的。
[0068]
(3)与轮回亲本孟麦023相比，山农0601、山农0602、山农0603、山农0604、山农0605、和山农0606的茎基腐病抗性水平显著提高(表3)，这说明源于十倍体长穗偃麦草抗茎基腐病基因fhb7的抗性强并且能够稳定遗传，可以用于小麦抗茎基腐病育种应用。
[0069]
表3携带小麦抗茎基腐病基因fhb7的孟麦023遗传改良株系的茎基腐病抗性鉴定
[0070][0071]
注：一列中表型值后的不同小写字母表明在p＜0.05时存在显著差异。