冷冻保存方案中不含其它冷冻保护剂的使用海藻糖的保存方法与流程

本发明涉及细胞和组织保存领域，具体地，本发明涉及细胞材料的冷冻保存方法，例如，例如，干细胞、造血干细胞、淋巴细胞、白细胞、t细胞(和t细胞亚群及car t-细胞)和胰岛，所述方法使用海藻糖，但不包含其他添加的冷冻保护剂，例如二甲亚砜(dmso)、丙三醇/甘油、乙二醇、丙二醇等。

背景技术：

1、研究中使用的大多数细胞是在向悬浮液细胞中添加5-10％ dmso后冷冻保存在冷冻管中的，随后以约-1℃/分钟的缓慢速率冷却，在零下高温(通常高于-10℃)有或没有诱导成核，并在-80℃或低于-135℃储存。

2、然而，存在难以保存的细胞类型和组织以及细胞产量非常重要的情况，例如，对于细胞治疗应用。仍需要改进细胞活力和产量并允许保存传统上难以保存的细胞类型的替代性方案和办法。由于新型细胞疗法的开发和基于细胞和组织的药物开发筛选试验变得更加普遍，需要有效的保存办法和方案，以便实现干细胞移植和分析等新兴疗法的潜在用途和益处。

3、随着对更快、更便宜地将药物推向市场的需求增加，需要更优、更具成本效益的高通量筛选技术和服务。缩短发现和验证之间的前置期是一个重要的开发领域，制药公司正在将其重点转向确定潜在药物的毒性。基于细胞和组织的试验是这种筛选的趋势。二十多年前，1997年，全球范围内的制药和生物科技公司已经花费了420亿美元用于研发，其中筛选占约59亿美元。环保公司正在从修复和清理活动转向监测和质量控制。此外，越来越多的公司正在使用外部来源筛选产品和服务。在所有这些领域中，需要能够提供成本效益的、可靠的和定量结果的细胞和组织试验系统。因此，非常需要能够增加细胞产物可用性并提高使用此类产物的效率的保存方法。

4、dmso是已发现的最有效且应用最广泛的冷冻保护剂。细胞冷冻保存通常涉及在含有dmso的培养基中以缓慢冷却速率冻结和在-135℃以下储存备用。细胞产量和活力非常重要的例子包括在生物反应器蛋白质生产运行的培养开始时昂贵延迟的最小化，和涉及将细胞给予患者以治疗多种疾病(例如癌症)的细胞疗法。虽然一些细胞(例如成纤维细胞)容易冷冻保存，但是其他细胞类型(如角质形成细胞、肝细胞和心肌细胞)不能良好地冻结，且细胞产量通常远低于50％。

5、目前的观点是，应当在将细胞输注给患者之前除去dmso(caselli等,造血干细胞移植期间接受二甲亚砜和吗啡的儿童的呼吸抑制和嗜睡(respiratory depression andsomnolence in children receiving dimethylsulfoxide and morphine duringhematopoietic stem cell transplantation.)haematologica,94:152–3,2009；junior等,与二甲亚砜保存的造血祖细胞输注相关的神经毒性(neurotoxicity associated withdimethyl sulfoxide-preserved hematopoietic progenitor cell infusion.)bonemarrow transplant,41:95–6,2008；mueller等,对患有和不患有已有的脑部疾病的患者输注二甲亚砜冷冻保存的外周血干细胞后的神经毒性(neurotoxicity upon infusion ofdimethylsulfoxide-cryopreserved peripheral blood stem cells in patients withand without pre-existing cerebral disease.)eur jhaematol,78:527–31,2007；otrock等,与输注dmso冷冻保存的自体血干细胞相关的短暂性全面遗忘症(transientglobal amnesia associated with the infusion of dmso-cryopreserved autologousblood stem cells.)haematologica,93:36–7,2008；和schlegel等,接受二甲亚砜(dmso)冷冻保存的外周血干细胞的儿科受者出现短暂意识丧失，与吗啡联合用药无关(transientloss of consciousness in pediatric recipients of dimethylsulfoxide(dmso)-cryopreserved peripheral blood stem cells independent of morphine co-medication.)haematologica,94:1473-5,2009)。因此，增加了有效使用这类细胞所需的时间。

6、dmso细胞毒性的机制尚未确定，然而，它被认为调节膜流动性，诱导细胞分化，引起胞质微管改变和金属复合物(barnett,二甲亚砜和甘油对na+,k+-atp酶和膜结构的影响(the effects of dimethylsulfoxide and glycerol on na+,k+-atpase and membranestructure.)cryobiology.1978；15(2):227-9；katsuda等,二甲亚砜对培养平滑肌细胞的细胞生长和超微结构特征的影响(the influence of dimethyl sulfoxide on cellgrowth and ultrastructural features of cultured smooth muscle cells.)jelectron microsc(tokyo).1984；33(3):239-41；katsuda等,二甲亚砜诱导培养的动脉平滑肌细胞中微管的形成(dimethyl sulfoxide induces microtubule formation incultured arterial smooth muscle cells.)cell biol int rep.1987；11(2):103-10；miranda等,二甲亚砜改变成肌细胞表型(alteration of myoblast phenotype bydimethyl sulfoxide.)proc natl acad sci u sa.1978；75(8):3826-30)。dmso也以剂量依赖方式减少胶原mrna的表达(zeng等,二甲亚砜降低人肝星状细胞和人包皮成纤维细胞中i型和iii型胶原蛋白的合成(dimethyl sulfoxide decrease type-i and–iiicollagensynthesis in human hepatic stellate cells and human foreskin fibroblasts.)advanced science letters,3:496–499,2010)。最近，已经报道了dmso对细胞周期进程和减数分裂纺锤体组织(li等,二甲亚砜扰动猪减数分裂卵母细胞的细胞周期进程和纺锤体组织(dimethyl sulfoxide perturbs cell cycle progression and spindleorganization in porcine meiotic oocytes.)plos one.2016年6月27日；11(6):e0158074)、蛋白质聚集(giugliarelli等,细胞中dmso诱导蛋白质聚集的证据(evidenceof dmso-induced protein aggregation in cells.)j phys chem a.2016年7月14日；120(27):5065-70)以及有可能干扰多种细胞过程的总体分子变化的影响(等,低剂量二甲亚砜驱动的总体分子变化有可能干扰多种细胞过程(low dose dimethyl sulfoxidedriven gross molecular changes have the potential to interfere with variouscellular processes.)sci rep.2018；8(1):14828)。

7、因此，需要能避免或改善使用dmso作为冷冻保护剂的结果的细胞冷冻保存方法。在这方面，二糖，例如海藻糖作为冷冻保护剂已被广泛研究。海藻糖成为有效冷冻保护剂的主要假说是海藻糖应该存在于细胞膜的两侧。海藻糖不被哺乳动物细胞代谢，不存在摄取海藻糖的主动哺乳动物转运机制。因此，在本公开的方法的发明之前，预期(仅)使用海藻糖具有非常低的活力和代谢功能价值(特别是在不存在dmso的情况下)。

8、本公开的方法解决了上述需求，并通过提供用于广泛的潜在应用的更高效、更具成本效益且更安全的储存和运输细胞材料的方法，提供了对现有细胞和组织疗法的改进。见图1。

9、本公开的方法还寻求增加细胞材料的可用性，该细胞材料例如，例如，干细胞、造血干细胞、间充质干细胞(例如人间充质干细胞、淋巴细胞、白细胞、t细胞(和t细胞亚群和car t细胞)以及胰岛)，并且能够增加这些改变寿命的细胞材料的使用(在一些情况下，该细胞能够在解冻后直接使用和/或输注给患者，无需任何间插步骤)。本公开的方法的应用还包括细胞和组织研究、基于细胞和组织的工程改造再生医学产品以及用于移植和毒理学筛选的细胞和组织建库。

技术实现思路

1、本公开提供了改进的保存方法，在冷冻保存方案中，在不存在其他添加的常规冷冻保护剂(例如dmso、丙三醇/甘油、乙二醇、丙二醇等，特别是dmso)的情况下使用海藻糖。

2、在一些实施方式中，本公开涉及通过置换常规冷冻保护剂(例如，那些已知有毒的，例如dmso和/或那些设计为在细胞或组织被冷冻保存于-80℃或更低温度复温后去除的冷冻保护剂)，提供了实现对细胞或组织的保护效果和低毒性的冷冻保存方法。本公开的方法提供了一种廉价且安全的冷冻保存方法，无需使用剧毒冷冻保护剂(例如dmso或其他常规冷冻保护剂，它们在细胞被浸入冷冻保存液并随后在-80℃或更低温冷冻保存时使用)。由于不使用dmso等常规冷冻保护剂，该细胞(在保存、储存过程中，在复温过程中或之后)经历的毒性保持在低水平，且该细胞能够在解冻后直接使用和/或输注给患者，无需任何间插步骤。在一些实施方式中，解冻的细胞或组织可以悬浮在培养基中以立即(即在复温过程后直接)开始培养过程(例如，在细胞或组织解冻后不进行洗涤)。

3、在一些实施方式中，本公开的方法涉及以维持所有细胞功能(例如，细胞包括，例如，干细胞、胰岛、间充质干细胞等的细胞)的方式冷冻保存培养的细胞。因此，改进了这些细胞的使用和/或移植的效率。例如，在一些实施方式中，本公开的方法涉及提供按需的、现成的一种或多种骨髓来源的人间充质干细胞(hmsc)，其从储存中复温后无需进一步处理/洗涤即用于治疗用途。在一些实施方式中，本公开的方法涉及泛t-细胞的冷冻保存，该方法使用海藻糖而不包含其他添加的冷冻保护剂，例如dmso或其他常规的冷冻保存剂(例如丙三醇/甘油、乙二醇、丙二醇等)，当细胞被浸入冷冻保存液并随后在-80℃或更低温冷冻保存时。

4、附图简要说明

5、图1说明了可能最终受益于细胞和组织疗法的潜在患者群体(美国患者总群体为1.22亿)。

6、图2是关于实验获得的数据的图示，该实验显示了冷冻保存后，所示浓度的海藻糖(不含dmso和含dmso)与仅dmso的对照相比，冷却速率对hmsc活力的影响；数据显示为平均值±平均值的1个标准误差。

7、图3a和3b是使用dmso和海藻糖的组合以-15℃/分钟冷冻保存后关于细胞存活获得的数据的图示(使用多种浓度的dmso及海藻糖冷冻保存细胞并复温)。含有5％ dmso的cryostor-5用作对照。测量了活细胞和死细胞计数(图3a)以及代谢活性(图3b)。数值是来自0.2-0.6m海藻糖的3次实验的9个重复的平均值(±sem)和来自0.8m海藻糖的cryostor-5对照的1次实验的3个重复的平均值(±sem)。