包封的微生物组合物及其制备方法与流程

本公开内容总体上涉及用于应用(例如植物种子处理)的稳定性提高的包封的微生物组合物。本公开内容总体上还涉及制备此类稳定性提高的包封的微生物组合物的方法和将包封的微生物组合物施用于植物种子的方法。

背景技术：

1、本部分提供涉及本公开内容的背景信息，其不一定是现有技术。

2、植物周围的微生物区系非常多样，包括细菌、真菌、酵母和藻类。构成植物微生物组的微生物(microbe)(亦称作微生物(microorganism))来自各种来源，包括种子、植物、土壤、传粉者和其他动物以及环境。这些微生物中的一些对其植物宿主有益并可促进植物生长和提高作物生产力，而其他微生物为致病微生物，通常称作病原体。在农业、园艺、林业和环境管理中使用微生物菌剂改善植物性状受到更多关注。已知存在于植物根周围土壤区域(通常称作根际和根面)的大量微生物因其促进植物生长的能力受到重视。此外，已发现微生物可用作生物防治剂提高农业生产力和效率，例如通过对抗植物病原体和/或促进植物生长。一些微生物可通过多种机制提升其宿主的适应潜力，例如固定分子氮，活化土壤养分(例如铁、磷、硫等)，合成植物激素和维生素，以及分解土壤中的植物物质(其可增加土壤有机物质)。通过给植物种子和/或土壤接种某些有益微生物，可向植物提供重要的养分或防治有害物和/或增强其生长和发育的有益因子。然而，微生物通常需要存活以对植物健康和性状产生积极影响，并且在储存或环境中或在植物或植物种子上可能不稳定。

3、因此，需要为例如长期保存和后续使用改进包含此类有益微生物的方法和组合物，所述有益微生物可纳入例如种子处理制剂、包衣和/或生物肥料或其他农业应用中。然而，已证明，在微生物的储存、运输和施用于植物或植物种子的过程中(尤其在不同温度和湿度下)保持其活力、结构和功能具有挑战性。尽管已开发稳定生物物质的方法和组合物，仍需要改进用于配制用于农业应用的微生物(例如细菌或真菌)的组合物和方法。事实上，许多非形成孢子的细菌和真菌菌株对储存和制剂条件尤其敏感，在使用现有制剂方法和策略的储存和农业应用的过程中可能无法存活。因此，进一步需要制备更稳定的组合物的方法以在不同温度和湿度(例如生物物质运输和存储过程中遇到的温度和湿度)下长期保存各种生物物质。另一方面，需要在施用于植物、植物部位或种子之前和之后保持稳定和活性的含微生物的组合物。

技术实现思路

1、本部分提供本公开内容的概述而非其全部范围或其所有特征的全面公开。

2、新的且有用的包封的微生物组合物及其制备方法阐述于随附的权利要求书中。同样提供了使本领域技术人员能够制备和使用所要求保护的主题的说明性实施方案。

3、一方面，描述了制备包封的微生物组合物的方法。此方法通常包括将微生物和至少一种水凝胶组合形成前体混合物，用交联剂固化前体混合物形成中间微生物组合物，以及干燥中间微生物组合物形成包封的微生物组合物。包封的微生物组合物的水分含量可小于或等于约10％或小于或等于约5％。至少一种水凝胶通常包括海藻酸盐，交联剂通常包括二价阳离子、二价阳离子盐或其组合。可在大于或等于约15℃的干燥温度下以小于或等于约25,000g/hr/m2的蒸发速率进行干燥。

4、另一方面，描述了制备包封的微生物组合物的方法。此方法通常包括将微生物和至少一种水凝胶组合形成前体混合物，用交联剂固化前体混合物形成中间微生物组合物，以及干燥中间微生物组合物形成包封的微生物组合物。至少一种水凝胶通常包括海藻酸盐，交联剂通常包括二价阳离子、二价阳离子盐或其组合。包封的微生物组合物的振实密度(tapped density)可大于或等于约0.5g/ml至小于或等于约1.5g/ml。

5、海藻酸盐可选自海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钡、海藻酸钙、海藻酸镁、海藻酸锶及其组合。

6、至少一种水凝胶还可包括羧甲基纤维素、卡拉胶、邻苯二甲酸醋酸纤维素、壳聚糖和壳聚糖衍生物、胶原、明胶、糖胺聚糖、瓜尔胶、阿拉伯胶、透明质酸、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、刺槐豆胶、甲基纤维素、果胶、聚环氧乙烷、聚乙醇酸、聚氨酯、淀粉、变性淀粉、黄原胶或其组合。

7、至少一种水凝胶可以约5重量％至约50重量％的量存在于前体混合物中，基于前体混合物的总重量计。

8、前体混合物可包含含氮稳定剂、含糖稳定剂或其组合。含氮稳定剂的实例包括氨、氢氧化铵、尿素、磷酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵、谷蛋白、水解酪蛋白、水解乳清蛋白、水解豌豆蛋白、水解大豆蛋白、麦芽提取物、奶粉、乳清粉、酵母提取物及其组合。含糖稳定剂的实例包括二糖、糖醇或其组合。例如，含糖稳定剂可选自甘露醇、山梨醇、木糖醇、海藻糖、蔗糖、乳糖及其组合。

9、含氮稳定剂和含糖稳定剂各自可以约5重量％至约50重量％的量存在于前体混合物中，基于前体混合物的总重量计。

10、微生物可为非形成孢子的细菌。例如，微生物可选自假单胞菌属(pseudomonas)(例如荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens))、慢生根瘤菌属(bradyrhizobium)(例如日本慢生根瘤菌(bradyrhizobium japonicum))、草螺菌属(herbaspirillum)(例如弗赖森草螺菌(herbaspirillum frisingense)、织片草螺菌(herbaspirillum seropedicae)、红苍白草螺菌(herbaspirillum rubrisubalbicans)等)、植物杆菌属(phytobacter)(例如重氮营养植物杆菌(phytobacter diazotrophicus)、乌尔新植物杆菌(phytobacterursingii)、棕榈植物杆菌(phytobacter palmae)等)、假食酸菌属(pseudacidovorax)(例如中型假食酸菌(pseudacidovorax intermedius))、松江菌属(mitsuaria)、固氮螺菌属(azospirillum)、伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)、金色单胞菌属(chryseomonas)、气单胞菌属(aeromonas)、不动杆菌属(acinetobacter)、寡养单胞菌属(stenotrophomonas)、色杆菌属(chromobacterium)、农杆菌属(agrobacterium)、金黄杆菌属(chryseobacterium)、致病杆菌属(xenorhabdus)、发光杆菌属(photorhabdus)及其组合。

11、前体混合物还可包含填充剂，例如淀粉、纤维素、生物炭、浮石、二氧化硅、粘土、沸石、珍珠岩或其组合。

12、填充剂可以约0.1重量％至约90重量％的量存在于前体混合物中，基于前体混合物的总重量计。

13、二价阳离子可为钡阳离子、钙阳离子、镁阳离子、锶阳离子、钴阳离子、镍阳离子、锌阳离子、锰阳离子或其组合。二价阳离子盐可为钡盐、钙盐、镁盐、锶盐、钴盐、锌盐、锰盐或其组合。

14、交联剂还可包含溶剂。

15、固化可包括使前体混合物的液滴与交联剂接触以形成交联珠形式的中间微生物组合物，所述交联珠的平均粒径例如为约1mm至约20mm。

16、此外或替代地，固化可包括使前体混合物流经直径例如为约100μm至约500μm的孔，并使前体混合物与交联剂接触以形成交联微珠形式的中间微生物组合物，所述交联微珠的平均粒径例如为约100μm至约20mm。

17、二价阳离子的存在量可为包封的微生物组合物的总干重的约0.1％至10％。

18、此外或替代地，固化可包括高剪切混合前体混合物和交联剂。例如，可在约4℃至约30℃的温度下以至少约3.5m/s(例如约3.5m/s至约25m/s)的叶尖速度进行高剪切混合至少约5秒(例如约5秒至约20分钟)。

19、此外或替代地，固化可包括将前体混合物和交联剂组合以形成中间微生物组合物，其中交联剂包括二价阳离子盐且二价阳离子盐为二价阳离子碳酸盐，例如碳酸钡、碳酸钙、碳酸镁、碳酸锶、碳酸钴、碳酸镍、碳酸锌、碳酸锰或其组合，尤其是碳酸钙。二价阳离子的存在量可等于包封的微生物组合物的总干重的约0.001％至约25％。

20、固化还可包括加入酸性缓冲液。例如，可将酸性缓冲液：(i)在将交联剂和前体混合物组合前加入至前体混合物和/或交联剂；(ii)和交联剂一起基本同时加入至前体混合物；(iii)加入至包含前体混合物和交联剂的混合物；或(i)、(ii)和(iii)的任何组合。此混合物的ph可为约4至约6.5。

21、可进行组合大于或等于约5分钟(例如约5分钟至约48小时)和/或在大于或等于约4℃(例如约4℃至约40℃)的温度下进行组合。

22、组合可包括混合前体混合物和交联剂。

23、方法还可包括将中间微生物组合物施用于基质，例如中间微生物组合物的形式为基质上的薄膜。薄膜的厚度可为约1mm至约1cm。

24、在所述方法中，干燥温度可为约15℃至约60℃和/或干燥时间可大于或等于约15分钟(例如约15分钟至约200小时)。

25、蒸发速率可小于或等于约15,000g/hr/m2，小于或等于约10,000g/hr/m2，小于或等于约5,000g/hr/m2，或为约1g/hr/m2至约500g/hr/m2、约50g/hr/m2至约500g/hr/m2、约1g/hr/m2至约250g/hr/m2或约1g/hr/m2至约100g/hr/m2。

26、方法还可包括对包封的微生物组合物进行处理以形成包封的微生物颗粒，和/或例如通过研磨包封的微生物颗粒，减小包封的微生物颗粒的尺寸至平均粒径小于或等于约200μm。

27、在25℃和65％相对湿度(rh)下4周、8周或12周后，包封的微生物组合物的每克菌落形成单位(cfu/g)的损失可小于两个对数单位或损失可小于一个对数单位。

28、方法还可包括将包封的微生物组合物施用于下述中的一种或多种：植物种子、植物、植物部位和植物环境。植物种子还可包含保护剂、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂或其组合。植物种子的实例包括蔬菜种子、水果种子、谷物种子及其组合。

29、方法还可包括将至少一种疏水添加剂与所述微生物和至少一种水凝胶组合形成前体混合物。

30、方法还可包括通过下述中的一种或多种来干燥中间微生物组合物形成包封的微生物组合物：风干中间微生物组合物、真空干燥中间微生物组合物和/或在流化床中干燥中间微生物组合物。

31、另一方面，描述了另一种制备包封的微生物组合物的方法。此方法通常包括将微生物和至少一种水凝胶组合形成前体混合物，用交联剂固化前体混合物形成交联珠形式的中间微生物组合物，以及干燥中间微生物组合物形成包封的微生物组合物。固化通常包括使前体混合物的液滴与交联剂接触。包封的微生物组合物的水分含量可小于或等于约10％。至少一种水凝胶通常包括海藻酸盐，交联剂通常包括二价阳离子、二价阳离子盐或其组合。

32、另一方面，描述了另一种制备包封的微生物组合物的方法。此方法通常包括将微生物和至少一种水凝胶组合形成前体混合物，用交联剂固化前体混合物形成交联微珠形式的中间微生物组合物，以及干燥中间微生物组合物形成包封的微生物组合物。固化通常包括使前体混合物流经直径为约100μm至约500μm的孔并使前体混合物与交联剂接触。包封的微生物组合物的水分含量可小于或等于约10％。至少一种水凝胶通常包括海藻酸盐，交联剂通常包括二价阳离子、二价阳离子盐或其组合。

33、另一方面，描述了另一种制备包封的微生物组合物的方法。此方法通常包括将微生物和至少一种水凝胶组合形成前体混合物，用交联剂固化前体混合物形成中间微生物组合物，以及干燥中间微生物组合物形成包封的微生物组合物。固化通常包括高剪切混合前体混合物和交联剂。包封的微生物组合物的水分含量可小于或等于约10％。至少一种水凝胶通常包括海藻酸盐，交联剂通常包括二价阳离子、二价阳离子盐或其组合。

34、另一方面，描述了另一种制备包封的微生物组合物的方法。此方法通常包括将微生物和至少一种包括海藻酸盐的水凝胶组合形成前体混合物，用包括二价阳离子盐的交联剂固化前体混合物形成中间微生物组合物，以及干燥中间微生物组合物形成包封的微生物组合物。固化通常包括将前体混合物和交联剂组合，且二价阳离子盐可为二价阳离子碳酸盐。包封的微生物组合物的水分含量可小于或等于约10％。

35、另一方面，描述了包封的微生物组合物。包封的微生物组合物通常包含包埋于聚合物基质(包含由二价阳离子结合在一起的至少一种水凝胶)中的微生物。至少一种水凝胶通常包括海藻酸盐。包封的微生物颗粒组合物的水分含量可小于或等于约10％或小于或等于约5％。

36、另一方面，描述了包封的微生物组合物。包封的微生物组合物通常包含包埋于聚合物基质(包含由二价阳离子结合在一起的至少一种水凝胶)中的微生物。至少一种水凝胶通常包括海藻酸盐。包封的微生物颗粒组合物的振实密度可大于或等于约0.5g/ml至小于或等于约1.5g/ml。

37、海藻酸盐可选自海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钡、海藻酸钙、海藻酸镁、海藻酸锶及其组合。

38、至少一种水凝胶还可包括羧甲基纤维素、卡拉胶、邻苯二甲酸醋酸纤维素、壳聚糖和壳聚糖衍生物、胶原、明胶、糖胺聚糖、瓜尔胶、阿拉伯胶、透明质酸、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、刺槐豆胶、甲基纤维素、果胶、聚环氧乙烷、聚乙醇酸、聚氨酯、淀粉、变性淀粉、黄原胶或其组合。

39、至少一种水凝胶可以约5重量％至约50重量％的量存在于组合物中，基于组合物的总重量计。

40、聚合物基质还可包含含氮稳定剂、含糖稳定剂或其组合。含氮稳定剂的实例包括氨、氢氧化铵、尿素、磷酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵、谷蛋白、水解酪蛋白、水解乳清蛋白、水解豌豆蛋白、水解大豆蛋白、麦芽提取物、奶粉、乳清粉、酵母提取物及其组合。含糖稳定剂的实例包括二糖、糖醇或其组合。例如，含糖稳定剂可选自甘露醇、山梨醇、木糖醇、海藻糖、蔗糖、乳糖及其组合。

41、含氮稳定剂和含糖稳定剂各自可以约5重量％至约50重量％的量存在于组合物中，基于组合物的总重量计。

42、微生物可为非形成孢子的细菌。例如，微生物可选自假单胞菌属(例如荧光假单胞菌)、慢生根瘤菌属(例如日本慢生根瘤菌)、草螺菌属(例如弗赖森草螺菌、织片草螺菌、红苍白草螺菌等)、植物杆菌属(例如重氮营养植物杆菌、乌尔新植物杆菌、棕榈植物杆菌等)、假食酸菌属(例如中型假食酸菌)、松江菌属、固氮螺菌属、伯克霍尔德氏菌属、金色单胞菌属、气单胞菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌属、色杆菌属、农杆菌属、金黄杆菌属、致病杆菌属、发光杆菌属及其组合。

43、聚合物基质还可包含填充剂，例如淀粉、纤维素、生物炭、浮石、二氧化硅、粘土、沸石、珍珠岩或其组合。

44、填充剂可以约0.1重量％至约90重量％的量存在于组合物中，基于组合物的总重量计。

45、二价阳离子可为钡阳离子、钙阳离子、镁阳离子、锶阳离子、钴阳离子、镍阳离子、锌阳离子、锰阳离子或其组合。

46、包封的微生物组合物的形式可为颗粒，其粒径例如小于或等于约300μm。

47、在25℃和65％相对湿度(rh)下4周、8周或12周后，包封的微生物组合物的每克菌落形成单位(cfu/g)的损失可小于两个对数单位或损失可小于一个对数单位。

48、聚合物基质还可包含至少一种疏水添加剂。

49、另一方面，描述了种子组合物。种子组合物通常包含植物种子和存在于植物种子的至少部分表面上的如本文所述的包封的微生物组合物。植物种子的实例包括蔬菜种子、水果种子、谷物种子及其组合。植物种子的其他实例包括油菜(canola)种子、玉米种子、大豆种子、小麦种子及其组合。

50、植物种子还可包含保护剂、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂或其组合。

51、种子组合物还可包含疏水包衣。

52、其他适用领域将由本文提供的描述显而易见。本概述的描述和特定实例仅为了举例说明，而不是为了限制本公开内容的范围。