香蕉果实褐变的延缓或预防的制作方法

根据一些实施方案，本发明涉及用于延缓或预防香蕉果实褐变的组合物和方法。在本发明的一些实施方案中，延缓或预防香蕉果实褐变通过遗传编辑编码多酚氧化酶(ppo)的一个或多个基因来实现。

背景技术：

1、栽培的香蕉及大蕉(plantains)是芭蕉属(musa)中的巨型草本植物。它们既无菌又单性结实(parthenocarpic)，因此发育成不具有种子的果实。栽培的杂交种及品种大多为三倍体，一些为二倍体或四倍体。大多数是从野生环境中发现的突变体繁殖而来。

2、香蕉属于更年性水果(climacteric fruit)，收获后绿色香蕉必须通过成熟过程来进行更年性变化(包括内部乙烯的产生、淀粉及原果胶的水解)，直到果肉变软、甜度增加并产生香气为止，从而增加其食用价值。常规上，香蕉在成熟之前收获，因此其运输和储存时间受到成熟进程长度的影响。由于在运输过程中会产生乙烯，香蕉果实可能经常会经历成熟。此外，所述果实可能会过度成熟、开始褐变并变质，从而降低市场价值。因此，需要控制香蕉果实的褐变。特别地，延缓或预防果实褐变的能力将促进香蕉果实的运输并将改善香蕉果实的保质期。多酚氧化酶(ppo)是影响果实褐变的重要因素之一。

3、多酚氧化酶(ppo)是在植物和动物界(包括大多数水果和蔬菜中，如香蕉)中发现的酶。ppo在食品工业中很重要，因为当组织因损伤或压迫而受损时，它们催化酶促褐变，使产品销路不佳并造成经济损失。由于ppo作用引起的酶促褐变也可导致产品的营养含量损失，进一步降低其价值。由于ppo反应的底物位于植物细胞的液泡中，ppo启动了褐变反应链。当水果切片或制成果泥时，暴露在氧气中也会导致ppo酶促褐变。已知ppo接受单酚和/或邻二酚作为底物，并且通过催化其中苯环上含有单个羟基取代基的单酚分子邻羟基化为邻二酚(在1、2位含有两个羟基取代基的酚分子，其间没有碳)而起作用。该酶还可以进一步催化邻二酚的氧化以产生邻醌。ppo催化邻醌快速聚合，产生黑色、褐色或红色色素(多酚)，导致水果褐变。因此，希望找到一种降低水果中活性ppo的水平或活性的方法，以努力延缓或预防水果(例如香蕉)的褐变。

4、减少ppo基因的表达以降低ppo水平或活性是预防果实褐变的一种方式(如在us9580723中对于苹果的记载，即所谓的“北极苹果”)。提高农业生产力的典型方法(如提高产量或工程化抗虫性)以前依赖于突变育种或通过转化将基因引入作物物种的基因组。然而，这些过程本质上是非特异性的并且相对低效。例如，植物转化方法递送整合到基因组随机位置中的外源dna。此外，这些整合的随机性使得难以预测是否发生了由于非预期的基因组破坏引起的多效性效应。基因组编辑技术的最新进展使得可能以比常规育种或标准基因工程更精确的方式改变活细胞中的dna序列，例如通过使用crispr-cas9基因编辑。

5、然而，不同于大多数其他主要粮食作物，香蕉很难进行基因改良。部分是因为香蕉物种是单性结实的(不产生有活力的种子)，因此通过有性繁殖去除遗传插入的序列是不可能的(例如去除使用引入cas9序列的农杆菌(agrobacteria)插入的转移dma、t-dna)。此外，由于几乎所有香蕉栽培品种和地方品种都是三倍体，具有高水平的雄性和雌性不育性，因此香蕉不可能回交，从而排除了将新性状渐渗到现有栽培品种中的可能性。此外，香蕉基因组的不完整注释和有限的表达数据不能提供关于最佳靶基因足够深度的信息。

6、本发明部分基于香蕉中9种不同ppo基因(称为ppo1-ppo9)的鉴定，特别是特定ppo的表征，例如ppo1、ppo2、ppo8、ppo9和ppo4在香蕉果实中表达，但其特征在于在其他组织中表达较低或不表达。根据本发明的一些实施方案，鉴定的ppo基因，特别是ppo1、ppo2、ppo8、ppo9和/或ppo4在本文中被靶向以延迟或预防香蕉果实中的褐变。先前，gooding等人，“molecular cloning and characterisation of banana fruit polyphenol oxidase”,planta,sep 2001；123(5):748-57使用简并引物鉴定香蕉ppo，其与本文中的任何ppo都不匹配，但与ppo4和ppo5最密切相关。wo9637617、wo9729193和wo9853080使用与下文gooding等人(2001)相同的简并引物，cn104404007公开了在香蕉中发现ppo基因，其在本文中被称为ppo8。

技术实现思路

1、本发明提供了降低香蕉植物或香蕉植物细胞中由ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶基因编码的至少一种内源ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶的水平或活性的方法。任选地，本发明的方法还包括从所述香蕉植物细胞再生香蕉植物。进一步任选地，本发明的方法进一步包括从所述香蕉植物收获果实。根据一些实施方案，降低至少一种内源ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶的水平或活性包括将修饰引入到编码所述至少一种ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶的ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶基因中。

2、本发明还提供了可通过本发明的上述方法获得的香蕉植物细胞、可通过本发明的上述方法获得的香蕉植物或植物部位、以及从可通过本发明的上述方法获得的香蕉植物收获的果实，其中所述果肉和/或果皮的特征在于与所述至少一种内源ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶的水平或活性未降低的香蕉植物的果肉和/或果皮相比，延缓和/或减少褐变的表型。

3、本发明还进一步提供了一种生产香蕉植物的方法，所述香蕉植物的特征在于与野生型香蕉植物相比果肉和/或果皮延缓和/或减少褐变的表型，所述方法包括：(a)向香蕉植物细胞提供crispr相关核酸内切酶或修饰的crispr相关核酸内切酶，以及一种或多种向导rna，其中所述crispr相关核酸内切酶或修饰的crispr相关核酸内切酶和所述一种或多种向导rna形成复合物，所述复合物使crispr相关核酸内切酶或修饰的crispr相关核酸内切酶能够在至少一种内源ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶基因中引入单链断裂或双链断裂，所述多酚氧化酶基因：(a)包含选自以下的编码序列：seq id no：5或与seq id no：5具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：6或与seq id no：6具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：12或与seq id no：12具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：13或与seq id no：13具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seq idno：8或与seq id no：8具有至少75％序列同一性的多核苷酸；(b)编码选自以下的多酚氧化酶：seq id no：40或与seq id no：40具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：41或与seq id no：41具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：47或与seq id no：47具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：48或与seq id no：48具有至少75％序列同一性的多肽；以及seq id no：43或与seq id no：43具有至少75％序列同一性的多肽；或(c)包含选自以下的多核苷酸序列：seq id no：151或与seq id no：151具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：152或与seq id no：152具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq idno：158或与seq id no：158具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：159或与seqid no：159具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seq id no：154或与seq id no：154具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及(b)鉴定至少一种香蕉植物细胞，所述香蕉植物细胞包含所述至少一种内源ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶基因的修饰，其中所述修饰选自：至少一个核苷酸插入；至少一个核苷酸缺失；至少一个核苷酸置换；或前述任何组合；以及从所述香蕉植物细胞再生香蕉植物，其中所述香蕉植物的特征在于与野生型香蕉植物相比，延缓和/或减少果肉和/或果皮褐变的表型。

4、本发明还提供了香蕉植物或植物部位，所述香蕉植物或植物部位在其基因组中包含至少一种修饰的内源ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶基因，其中所述修饰导致以下酶的功能降低或丧失：由所述修饰的内源ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶基因编码的至少一种内源ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶，其中所述修饰位于至少一种内源ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶基因中，所述多酚氧化酶基因：(a)包含选自以下的编码序列：seq id no：5或与seq id no：5具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：6或与seq id no：6具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：12或与seq id no：12具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：13或与seq id no：13具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seq id no：8或与seq id no：8具有至少75％序列同一性的多核苷酸；(b)编码选自以下的多酚氧化酶：seq id no：40或与seq id no：40具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：41或与seq id no：41具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：47或与seq id no：47具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：48或与seq id no：48具有至少75％序列同一性的多肽；以及seq id no：43或与seq id no：43具有至少75％序列同一性的多肽；或(c)包含选自以下的多核苷酸序列：seq id no：151或与seq id no：151具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：152或与seq id no：152具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：158或与seq id no：158具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：159或与seq id no：159具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seq id no：154或与seq id no：154具有至少75％序列同一性的多核苷酸。

5、本发明还提供了从本发明的香蕉植物收获的香蕉果实，其中所述果实的特征在于与其中所述至少一种内源ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶的水平或活性未降低的香蕉植物的果实相比，延缓和/或减少褐变的表型。本发明还提供了一种获得香蕉果实食品的方法，所述方法包括加工本发明的香蕉果实。

6、本发明还进一步提供了包含香蕉ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶多核苷酸的dna序列，所述多核苷酸：(a)包含选自以下的编码序列：seq id no：5或与seq id no：5具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：6或与seq id no：6具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：12或与seq id no：12具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：13或与seq id no：13具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seq id no：8或与seq id no：8具有至少75％序列同一性的多核苷酸；(b)编码选自以下的多酚氧化酶：seq id no：40或与seq id no：40具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：41或与seqid no：41具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：47或与seq id no：47具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：48或与seq id no：48具有至少75％序列同一性的多肽；以及seq id no：43或与seq id no：43具有至少75％序列同一性的多肽；或(c)包含选自以下的多核苷酸序列：seq id no：151或与seq id no：151具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：152或与seq id no：152具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：158或与seq id no：158具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：159或与seq idno：159具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seq id no：154或与seq id no：154具有至少75％序列同一性的多核苷酸。

7、本发明还提供了包含香蕉ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶多核苷酸的dna构建体或载体，所述多核苷酸：(a)包含选自以下的编码序列：seq id no：5或与seq idno：5具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：6或与seq id no：6具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：12或与seq id no：12具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：13或与seq id no：13具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seq idno：8或与seq id no：8具有至少75％序列同一性的多核苷酸；(b)编码选自以下的多酚氧化酶：seq id no：40或与seq id no：40具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：41或与seq id no：41具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：47或与seq id no：47具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：48或与seq id no：48具有至少75％序列同一性的多肽；以及seq id no：43或与seq id no：43具有至少75％序列同一性的多肽；或(c)包含选自以下的多核苷酸序列：seq id no：151或与seq id no：151具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：152或与seq id no：152具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq idno：158或与seq id no：158具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：159或与seqid no：159具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seq id no：154或与seq id no：154具有至少75％序列同一性的多核苷酸。本发明还进一步提供了用本发明的载体转化的植物细胞，任选地其中所述植物细胞是香蕉植物细胞。

8、本发明还提供了一种多酚氧化酶蛋白，所述蛋白：由seq id no：5、seq id no：6、seq id no：12、seq id no：13或seq id no：8编码，或由与seq id no：5、seq id no：6、seqid no：12、seq id no：13或seq id no：8具有至少75％序列同一性的多核苷酸编码；包含seq id no：40，seq id no：41，seq id no：47，seq id no：48或seq id no：43，或包含与seqid no：40、seq id no：41、seq id no：47、seq id no：48或seq id no：43具有至少75％序列同一性的序列；或由seq id no：151、seq id no：152、seq id no：158、seq id no：159或seqid no：154编码，或由与seq id no：151、seq id no：152、seq id no：158、seq id no：159或seq id no：154具有至少75％序列同一性的多核苷酸编码。

9、本发明还进一步提供了在植物细胞中表达多酚氧化酶的方法，其中所述方法包括将香蕉多酚氧化酶多核苷酸引入到所述植物细胞中，所述多核苷酸：(a)包含选自以下的编码序列：seq id no：5或与seq id no：5具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：6或与seq id no：6具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：12或与seq id no：12具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：13或与seq id no：13具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seq id no：8或与seq id no：8具有至少75％序列同一性的多核苷酸；(b)编码选自以下的多酚氧化酶：seq id no：40或与seq id no：40具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：41或与seq id no：41具有至少75％序列同一性的多肽；seq idno：47或与seq id no：47具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：48或与seq id no：48具有至少75％序列同一性的多肽；以及seq id no：43或与seq id no：43具有至少75％序列同一性的多肽；或(c)包含选自以下的多核苷酸序列：seq id no：151或与seq id no：151具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：152或与seq id no：152具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：158或与seq id no：158具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：159或与seq id no：159具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seqid no：154或与seq id no：154具有至少75％序列同一性的多核苷酸；其可操作地连接至在植物细胞中有活性的启动子。

10、本发明还提供了一种合成的香蕉多酚氧化酶向导rna，其包含选自以下的可变区：seq id no：32；seq id no：33；seq id no：34；seq id no：35；seq id no：57；seq id no：58；seq id no：38；seq id no：39；seq id no：62；seq id no：76；以及seq id no：77。

11、本发明还进一步提供了一种重组dna构建体，其包含可操作地连接至表达至少一种香蕉ppo1、ppo2、ppo8、ppo9或ppo4多酚氧化酶向导rna的核苷酸序列的启动子，其中所述向导rna能够与crispr相关核酸内切酶或修饰的crispr相关核酸内切酶形成复合物，并且其中所述复合物能够结合香蕉基因组中的至少一种内源香蕉ppo1、ppo2、ppo8或ppo9多酚氧化酶基因并在其中产生双链或单链断裂，所述多酚氧化酶基因：(a)包含选自以下的编码序列：seq id no：5或与seq id no：5具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：6或与seq id no：6具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：12或与seq id no：12具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：13或与seq id no：13具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seq id no：8或与seq id no：8具有至少75％序列同一性的多核苷酸；(b)编码选自以下的多酚氧化酶：seq id no：40或与seq id no：40具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：41或与seq id no：41具有至少75％序列同一性的多肽；seq idno：47或与seq id no：47具有至少75％序列同一性的多肽；seq id no：48或与seq id no：48具有至少75％序列同一性的多肽；以及seq id no：43或与seq id no：43具有至少75％序列同一性的多肽；或(c)包含选自以下的多核苷酸序列：seq id no：151或与seq id no：151具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：152或与seq id no：152具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：158或与seq id no：158具有至少75％序列同一性的多核苷酸；seq id no：159或与seq id no：159具有至少75％序列同一性的多核苷酸；以及seqid no：154或与seq id no：154具有至少75％序列同一性的多核苷酸。

12、附图和序列表的简要说明

13、从以下对附图和序列表的说明可以更全面地理解本公开内容，附图和序列表构成本技术的一部分。