一种增加NK细胞冻存复苏后活性的方法及其应用与流程

本发明属于细胞冻存，涉及一种免疫冻存复苏后活性的方法及其应用，具体涉及一种增加nk细胞冻存复苏后活性的方法及其应用。

背景技术：

1、人nk细胞是以cd3-cd56+为标志的大颗粒淋巴细胞。nk细胞作为免疫系统的重要组成部分，在对抗病原体感染和肿瘤免疫监视中担任着哨兵和前线防御者的角色。与t、b细胞不同，nk细胞不表达基因重排的抗原特异性受体，而是依赖一系列种系基因编码的受体。正常组织细胞由于高表达mhcⅰ类分子，可与nk细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer-cell immunoglobulin-like receptor,kir)家族抑制性受体结合，传递抑制信号，从而免受nk细胞攻击；而感染或转化的细胞通常下调表达mhcⅰ类分子，尽管可以因此逃避mhcⅰ限制性t细胞的识别，但可减弱mhcⅰ类分子和nk细胞抑制性受体结合传递的抑制信号，使nk细胞激活并杀伤感染或转化的细胞。由于利用nk细胞在对肿瘤的生物治疗中显示了巨大的应用潜力，人们一直在寻找最优的扩增活化nk细胞的方法。

2、nk细胞的保存也是制约nk细胞应用的重要步骤。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。在不加保护剂条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、ph值改变、蛋白质变性等，对细胞造成不可逆的永久损伤，甚至引起细胞死亡。

3、现有的冻存方法对于nk细胞，在复苏后存在细胞存活率降低、细胞活性低下等问题，nk细胞的临床应用需要能更好维持nk细胞活性的冻存方法。

4、cn115462368a公开了一种nk细胞冻存液，包括基础培养基和添加在基础培养基中的以下组分：右旋糖酐、维生素c、黑沙蒿多糖、育亨宾、白藜芦醇。其中右旋糖酐、维生素c、黑沙蒿多糖、育亨宾、白藜芦醇各组分协同作用，为nk细胞在冻存过程中提供保护，减少冻存过程中对nk造成的损伤。经冻存后的nk细胞存活率下降不明显，并且仍具有较好的杀伤活性，可在快速复苏后应用于临床等领域。

5、cn112400863a公开了一种临床用nk细胞冻存液及冻存方法，按体积百分比包括以下组分：二甲基亚砜3-10％、甘油2-4％、右旋糖酐13-20％、聚乙烯吡咯烷酮0.1-0.2％、n-乙酰半胱氨酸5-10％、葡萄糖溶液60-70％。该发明可直接用于静脉注射，dmso含量较低，无论对人体亦或冻存的细胞的毒性大大降低，更加安全；能够较好的保存细胞活性和杀伤能力，减少了冻存过程中对细胞造成的损伤。

6、但现有技术中针对nk细胞的冻存策略还非常有限，因此，开发出更多的保持nk细胞冻存复苏后的存活率、杀伤活力的冻存方案是非常有必要的。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种免疫冻存复苏后活性的方法及其应用，具体提供一种增加nk细胞冻存复苏后活性的方法及其应用。这种方法能很好地增加nk细胞在冻存复苏后的活率和靶细胞杀伤能力。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种增加nk细胞冻存复苏后活性的方法，所述方法包括：将待冻存的nk细胞于冻存前先与l-脯氨酸和β-巯基乙醇混合培养，然后再与nk细胞冻存液混合，得到细胞悬液，将细胞悬液置于无菌冻存管中，于液氮中冻存。

4、本发明创造性地发现在冻存前的nk细胞培养阶段向培养体系中添加l-脯氨酸和β-巯基乙醇，能够使冻存复苏后仍保持较高的细胞存活率和杀伤能力。其中l-脯氨酸在冷冻过程中可以进入细胞内，与细胞内水分子和蛋白结合，保护细胞内蛋白质及酶的结构与活性，其冷冻保护机制主要有抑制冰晶的形成、保水及结合蛋白、保护细胞膜和抗氧化应激作用。其中β-巯基乙醇作为一种强还原剂，能够中和细胞培养基中积累的氧自由基从而改善细胞周围环境，使得同样体积细胞增殖的数量更多；β-巯基乙醇可将胱氨酸还原为可被细胞转运的形式，然后转化为细胞生长所需的半胱氨酸。这种方法提供了一种冻存剂配方改良以外的nk细胞保存策略，可以减少冻存剂中二甲基亚砜等细胞保护剂的用量，使冻存液对冻存细胞和人体的毒性大大降低，以及降低成本。

5、优选地，所述与l-脯氨酸和β-巯基乙醇混合培养于冻存前24-72h(例如24h、30h、36h、42h、48h、72h等)开始。

6、优选地，所述l-脯氨酸在混合培养体系中的浓度为100-2000μm(例如100μm、300μm、500μm、800μm、1000μm、1200μm、1500μm、2000μm等)，所述β-巯基乙醇在混合培养体系中的浓度为0.1-50μm(例如0.1μm、1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、30μm、40μm、50μm等)。

7、当l-脯氨酸和β-巯基乙醇以上述特定的浓度进行添加时，在保持较高的细胞存活率和杀伤能力方面具有更显著的技术效果。

8、优选地，所述nk细胞在所述细胞悬液中的浓度为(1×106)-(4×107)个/ml，例如1×106个/ml、3×106个/ml、5×106个/ml、8×106个/ml、1×107个/ml、2×107个/ml、3×107个/ml、4×107个/ml等。

9、上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

10、上述方法可以配合任何现有技术中公开的nk细胞冻存液进行使用，但使用下述特定的nk细胞冻存液时，具有更好的维持较高的细胞存活率和杀伤能力的技术效果。

11、优选地，所述nk细胞冻存液的组分包括：二甲基亚砜、人血白蛋白、聚乙二醇、右旋糖酐、维生素b12和生理盐水。

12、其中渗透性保护剂二甲基亚砜能够在细胞冷冻悬液完全凝固之前，穿过细胞膜渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩，同时改变细胞膜的通透性，保护细胞膜，减少在冻存过程中细胞内冰晶形成。

13、其中非渗透性保护剂人血白蛋白、聚乙二醇和右旋糖酐三者能够潜在地互相正向影响，在维持nk细胞冻存复苏后的活率和靶细胞杀伤能力上具有协同促进作用。其可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量；使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。而且能够减少二甲基亚砜的用量，使冻存液对冻存细胞和人体的毒性大大降低。

14、优选地，所述nk细胞冻存液的组分以质量百分含量计包括：二甲基亚砜5-10％、人血白蛋白0.1-1％、聚乙二醇0.05-2％、右旋糖酐0.2-2％和生理盐水。

15、本发明所涉及的nk细胞冻存液中各组分以上述特定的质量配比方式进行组合时，具有更优的配合效果，在减少细胞在冻存复苏过程中受到伤害、增加nk细胞活率和杀伤能力方面具有更优的技术效果。

16、所述二甲基亚砜在所述nk细胞冻存液中的质量百分含量可以选择为5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％等。

17、所述人血白蛋白在所述nk细胞冻存液中的质量百分含量可以选择为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等。

18、所述聚乙二醇在所述nk细胞冻存液中的质量百分含量可以选择为0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、0.55％、0.6％、0.8％、1％、1.5％、2％等。

19、所述右旋糖酐在所述nkt细胞冻存液中的质量百分含量可以选择为0.2％、0.3％、0.5％、0.7％、1％、1.2％、1.4％、1.5％、1.6％、1.8％、2％等。

20、上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

21、优选地，所述nk细胞冻存液的组分还包括：浓度为5-50ng/ml的维生素b12，例如5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

22、在本发明所涉及的nk细胞冻存液中添加辅酶维生素b12有助于进一步提高nk细胞复苏后维持活率和杀伤靶细胞的能力。

23、优选地，所述右旋糖酐选自右旋糖酐20、右旋糖酐40或右旋糖酐70中的任意一种或至少两种的组合。

24、优选地，所述聚乙二醇的分子量为2000-6000，例如聚乙二醇2000、聚乙二醇3000、聚乙二醇4000、聚乙二醇5000、聚乙二醇6000等。

25、优选地，所述nk细胞冻存液由如下方法制得：以生理盐水为溶解介质，将二甲基亚砜、人血白蛋白、聚乙二醇、右旋糖酐、可选的维生素b12均匀溶解于生理盐水中即可。

26、第二方面，本发明提供根据第一方面所述的增加nk细胞冻存复苏后活性的方法在对nk细胞进行保存中的应用。

27、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

28、本发明创造性地发现在冻存前的nk细胞培养阶段向培养体系中添加l-脯氨酸和β-巯基乙醇，能够使冻存复苏后仍保持较高的细胞存活率和杀伤能力。其中l-脯氨酸在冷冻过程中可以进入细胞内，与细胞内水分子和蛋白结合，保护细胞内蛋白质及酶的结构与活性，其冷冻保护机制主要有抑制冰晶的形成、保水及结合蛋白、保护细胞膜和抗氧化应激作用。其中β-巯基乙醇作为一种强还原剂，能够中和细胞培养基中积累的氧自由基从而改善细胞周围环境，使得同样体积细胞增殖的数量更多；β-巯基乙醇可将胱氨酸还原为可被细胞转运的形式，然后转化为细胞生长所需的半胱氨酸。这种方法提供了一种冻存剂配方改良以外的nk细胞保存策略，可以减少冻存剂中二甲基亚砜等细胞保护剂的用量，使冻存液对冻存细胞和人体的毒性大大降低，以及降低成本。