滇西乌头组培快繁方法及应用

本发明涉及药用植物组织培养及中药材领域，具体涉及滇西乌头组培快繁方法及应用。

背景技术：

1、滇西乌头（acnoitum bulleyanum）属于毛莨科乌头属中药材，而全世界乌头属有350种，我国具有162种数十变种，据《中华本草》记载，我国整个乌头属中属于药用植物的有铁棒锤（a. pendaulum）、北乌头（a.kusnezoffii）、滇南草乌（a.austroyunnanense）、黄草乌（a.vilmorinianum）等40余种，其中药材以雪上一枝蒿、川乌、附子、黄草乌、大草乌等最为著名。乌头属药用植物其内含二萜类生物碱，主要包括乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等，具有祛风除湿、温经止痛的功效，主要用于治疗跌打损伤，关节炎，神经性疼痛，中风瘫痪，胃肠炎，痈疽疮毒等症，是我国云南白药、无敌膏、一枝蒿速效止痛搽剂等伤科中药制剂必用中药材。

2、滇西乌头为多年生草本植物，主要生长于海拔3200～3500米的山地林边或溪边，为云南特有的乌头属植物之一，主要分布于云南的大理、丽江、维西等滇西高海拔地区。滇西乌头与其他药用乌头属植物类似，其内含大量二萜类生物碱，具有大毒。但滇西乌头其并非为《中华本草》记载的药用乌头属中药材，而是滇西民间常用伤科药，在大理、丽江等高寒山区常用于煮食，以达到强身健体，舒筋活血的目的。

3、后经云南各科研单位研究发现，滇西乌头内含较为少有的特殊生物碱-草乌甲素，是制备草乌甲素注射液、草乌甲素片、草乌甲素口服液等相关制剂的主要活性原料。至本世纪初，滇西乌头中草乌甲素含量还是较高的，最高时可达1%，而相关制药企业收购的标准为0.3%。但随着野生资源的无序采挖，野生滇西乌头逐步耗尽，后在大理、丽江、迪庆等地开始逐步进行滇西乌头的人工引种驯化种植，但近年来发现，人工种植的滇西乌头中草乌甲素的含量逐年下降，各制药企业亦因原料问题，将其药材收购标准从原来的0.3%降低至0.1%，有的甚至降低至0.06%。而低含量的滇西乌头药材，一方面使得草乌甲素提取收率极大的降低，另一方面，由于含量低，使得提取成本成倍的增长，最终使得草乌甲素价格突飞猛涨。

4、究其滇西乌头中草乌甲素含量逐年降低的原因，可能为滇西乌头常年采用分株繁殖的方式，使得品种退化，导致草乌甲素含量降低，而种子繁殖因种植地块一般或多或少的参杂有其他乌头属品种，使得滇西草乌与其他乌头属品种杂交，从而获得杂交的滇西乌头，最终使滇西乌头中草乌甲素含量逐年降低。

5、现有关于毛莨科乌头属植物的组培技术有一定的研究，但在滇西乌头上没有相关报道，而现有乌头属其他植物的组培技术在滇西乌头上应用率低甚至不能应用，急需发明一种新的方法来满足滇西乌头快速繁殖的需求。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术不足，利用现代生物技术，特发明了一种滇西乌头的组培快繁技术，可为优质滇西乌头的种植提供数量充足、品质稳定的种苗。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种滇西乌头组培快繁方法，步骤包括：

3、（1）外植体选择与清洁：选择滇西乌头顶端15～25cm茎段作为外植体，去叶后剪成3～4cm具芽小段，用饱和肥皂水溶液涮洗10～15min，后用自来水洗净表面肥皂水，再滴加2～3滴吐温-80，震摇10～15min，最后用自来水冲淋60～70min；

4、（2）外植体消毒：清洁完的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒15～20s、无菌水涮洗2～3次，饱和漂白粉溶液消毒15～20min、无菌水涮洗3～4次，25%双氧水溶液消毒2～3min、无菌水涮洗2～3次，5%双氧水溶液消毒20～25min、无菌水涮洗4～5次；

5、（3）初代诱导培养：消毒的外植体用无菌纸吸去表面水分，剪掉两端伤口，并将其剪成1～2cm具芽小段，接种于ms+naa 0.1～0.2mg/l+zt 0.5～0.8mg/l+kt 2.0～3.0mg/l+硝酸银 0.2～0.3μg/l+活性炭1.0g/l的初代诱导培养基中，在5±2℃温度下全黑暗培养7天，后转移至温度为25±2℃，光照强度2000～3000lx，日照光12h的光暗交替环境下培养40～50天；

6、（4）继代增殖培养：诱导出的丛生芽剪成单芽，接种在ms+cppu 0.05～0.08mg/l+tdz 0.5～0.6mg/l+br 0.08~0.1mg/l+椰汁 60～80ml/l+硝酸银 0.1～0.15μg/l的继代增殖培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2000～3000lx，日照光12h的光暗交替环境下培养30～40天；

7、（5）生根培养：增殖培养获得的丛生芽剪成单芽，接种于1/2改良ms+naa 0.4～0.6mg/l+iba 0.2～0.3mg/l+椰汁100～120ml/l+硝酸银 0.05～0.1μg/l的生根培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2000～3000lx，日照光12h的光暗交替环境下培养30～40天；

8、（6）驯化：将生根苗从瓶内去除，洗净基部培养基，移栽于质量比为5:1的泥炭土和珍珠岩的基质中，在70%遮阴率的大棚下驯化。

9、进一步的，步骤（5）中，所述的改良ms培养基为其余元素不变，蔗糖浓度调整为12～15g/l。

10、本发明的有益技术效果是：

11、1、本发明是利用组培快繁技术进行的种苗繁育，属于无性繁殖范畴，能最大程度的保持母本的优良性状，同时，无性繁殖虽存在一定周期的退化可能性，但在组培繁育过程中，可不断进行原母本的初代培养，从而减少无性繁殖代数，最终获得品质极其稳定的滇西乌头苗。

12、2、常规组培消毒技术常采用0.1%升汞溶液进行消毒，而滇西乌头以及乌头属其他品种不论采用多大浓度、多长时间的升汞消毒时，均会导致100%的褐化率，而滇西乌头的褐化直接导致其不能诱导出丛生芽，同时褐化亦会直接影响继代增殖及无根苗的生根。本发明在消毒时未采用升汞溶液进行消毒，而采用了75%酒精、饱和漂白粉溶液以及高浓度的双氧水短时消毒与低浓度的双氧水长时消毒相结合的消毒方式，能最大程度的降低消毒污染率和消毒死亡率，还减少了消毒剂对外植体的伤害，最终降低了初代的褐化率。而在初代培养时，进行了低温培养，有利于抑制滇西乌头初代培养时的褐化发生，同时在初代诱导、继代增殖以及生根培养时，均使用一定浓度的硝酸银和活性炭的结合，使初代诱导、继代增殖及生根培养时的褐化率降至不影响丛生芽的诱导、增殖及生根。

13、3、本发明在继代增殖培养时，进行了一定浓度的cppu、tdz及br的有机搭配，同时添加了一定浓度的椰汁，增殖系数可达6，同时，由于椰汁的添加，使得增殖过程中丛生芽极其健壮，减少了常规组培技术中的壮苗步骤。

14、4、本发明在生根培养时，使用了低浓度的naa和iba搭配使用，并添加了高浓度的椰汁，可使生根率可达100%，同时由于低浓度的生长素搭配以及适宜的添加了椰汁，并降低了常规ms培养基中的糖浓度，有利于在生根培养过程中瓶苗的块根形成。