一种红花荷的组织培养方法与流程

本发明涉及植物繁殖，具体而言涉及一种红花荷的组织培养方法。

背景技术：

1、在植物繁殖技术领域，组织培养是植物的人工营养繁殖方法之一。红花荷(学名：rhodoleiachampioniihook.f.)：金缕梅科红花荷属常绿乔木，高可达12米，红花荷多被广泛种植作观赏用途。红花荷的花形像吊钟，而且体积颇大，所以又名“吊钟王”。但红花荷结实少，繁育困难，而且难以规模化的保持优良性状繁育。因此，开发一种红花荷组培苗快速繁育方法显得很有必要。

2、现有技术中，申请号为cn201610166219.8的发明专利中公开了一种红花荷组培苗快速繁育方法，种子经催芽播种后，在幼苗期间选育，以幼苗的顶芽为外植体，通过外植体消毒、诱导培养、丛生芽增殖、不定根发生、炼苗移栽等过程获得了红花荷离体再植株，建立红花荷组织培养快速繁殖技术体系，可以保持红花荷母本的优良性状，有利于红花荷优良无性系苗木的规模化生产。该方法采用在幼苗期间选育，并以幼苗的顶芽为外植体，建立了红花荷的组织培养快速繁殖技术体系。然而，上述组织培养方法的培育过程比较复杂，培育周期长，在生根培养以后还需要进行炼苗移栽操作，增加了工作量；组织培养过程中，外植体在诱导阶段和生根阶段都比较容易出现褐化死亡，现有技术中均没有采用相应的减少或者预防褐化的措施；此外，红花荷容易出现的玻璃化现象也需要进一步控制。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种红花荷的组织培养方法，通过采用低氮培养基培养，减少红花荷玻璃化现象，添加酪氨酸和有机物形成不同的培养基配方，以满足不同阶段苗木对营养的需求；通过采用母本遮光处理的方式，极大提高了红花荷的诱导成活率，可以在短时间内得到更多的红花荷苗。

2、本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种红花荷的组织培养方法，所述培养方法包括，红花荷外植体的前处理、红花荷外植体的采取、红花荷外植体的消毒、红花荷外植体的诱导培养、红花荷芽的增殖培养、红花荷芽的壮苗培养以及红花荷苗的生根培养；

3、其中，所述前处理包括选取红花荷高50～80cm中等大小的无病无虫害的盆栽嫁接苗，将盆栽苗搬入温室大棚遮光50％处理一个月；促使盆栽苗长出嫩芽枝条，在此期间只浇水不施肥，从盆栽苗基部浇水，避免水落到新长出嫩芽枝条上增加组培污染率；一个月之后进行采集，将采集好的红花荷外植体进行消毒；消毒完成后进行诱导培养；

4、所述诱导培养基由wpm+酪氨酸100mg/l+叶酸2ml/l+6-ba 1～3mg/l+naa0.1mg/l+糖20g/l+琼脂5.5g/l+苹果酸1ml/l组成，ph调至5.6～5.8，每瓶接种一个外植体；所述增殖培养的培养基由wpm+叶酸2ml/l+酪氨酸100mg/l+6-ba 0.5～1.5mg/l+naa0.1mg/l+糖20g/l+琼脂5.5g/l+苹果酸1ml/l组成，ph调至5.6～5.8；所述壮苗培养的培养基由wpm+酪氨酸100mg/l+叶酸2ml/l+naa 0～0.3mg/l+糖20g/l+琼脂6g/l+苹果酸1ml/l组成，ph调至5.6～5.8；所述生根培养的培养基由1/2wpm+叶酸2ml/l+iba0.3mg/l+糖20g/l+琼脂6g/l+苹果酸1ml/l组成，ph调至5.6～5.8。

5、优选地，所述诱导培养基由wpm+酪氨酸100mg/l+叶酸2ml/l+6-ba1mg/l+naa0.1mg/l+糖20g/l+琼脂5.5g/l+苹果酸1ml/l组成；所述增殖培养的培养基由wpm+叶酸2ml/l+酪氨酸100mg/l+6-ba 0.5mg/l+naa0.1mg/l+糖20g/l+琼脂5.5g/l+苹果酸1ml/l组成；所述壮苗培养的培养基由wpm+酪氨酸100mg/l+叶酸2ml/l+naa 0.1mg/l+糖20g/l+琼脂6g/l+苹果酸1ml/l组成。

6、进一步地，所述采集包括将用75％的酒精消毒过的剪刀剪取红花荷盆栽苗新长出的长约15～20cm的嫩芽枝条，去除全部叶片，剪截成带2～3个腋芽的茎段作为外植体。

7、进一步地，所述消毒包括将采集好的红花荷外植体在超净工作台上先用75％的酒精消毒60s，并用手不断摇晃；之后倒掉酒精用无菌水清洗3～5次，每次清洗一分钟，然后倒入2％的naclo溶液，并加入3～5滴吐温80消毒12～15分钟，轻轻摇晃使外植体与消毒液充分接触。

8、进一步地，所述诱导培养具体为，将消毒好后的外植体用无菌水清洗3～5次，每次清洗一分钟，然后用消毒好的镊子将消毒好的外植体夹到无菌盘中，用无菌手术刀将外植体的两端漂白的部分切掉，将消毒好后的外植体切割成一段一个腋芽，接种在含有诱导培养基的培养瓶中；将接种好的培养瓶放在培养架上黑暗培养7天有利于减少褐化，7天后打开灯光，灯源为冷光源，光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果培养一个月后外植体长出单芽。

9、进一步地，所述增殖培养具体为，将诱导培养后的单芽从茎段上切割下来，将单芽分割成茎段接种至含有增殖培养基的培养瓶中，每瓶接种10个茎段；光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果单芽接种到增殖培养基中30天左右会长出2～3棵芽。

10、进一步地，所述壮苗培养具体为，将增殖培养基中新长出来的芽，切割成单芽接种至含有壮苗培养基的培养瓶中，每瓶接种10棵芽；光照强度为3000lx～5000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果30天之后丛生芽会长成具有2～3个节和4～5片叶子的组培苗。

11、进一步地，所述生根培养具体为，等到红花荷中的小芽在壮苗培养基中长至2～3个节时，将小苗接种至含有生根培养基的培养瓶中，每瓶接种10棵苗；暗培养7天，然后打开灯管光照强度控制在3000lx-5000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果30天之后会长出3条以上的根。

12、本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明提供的红花荷的组织培养方法，具有以下几点优势：

13、1)本发明采用无性组织培养的技术，提高了红花荷的繁殖率，传统的繁殖方式比如扦插、嫁接这些需要大量的母本方可实行切系数不高，组培的这个红花荷品种属于公司优选品种，母本较少所以如果按照传统的繁殖方法难以满足规模化生产的需求，而采用本发明方法，繁殖量呈指数倍增加，能满足红花荷商业化生产需求；

14、2)本发明在外植体消毒过程中进行了外植体遮光处理，使外植体消毒成功及消毒后的成活率更高；

15、3)本发明在外植体诱导阶段采用黑暗培养7天，极大减少了外植体褐化死亡的数量，增加外植体腋芽生长的成功率；

16、4)本发明在生根诱导阶段采用黑暗培养7天，减少了小苗的褐化程度，使切口加速愈合长根；

17、5)本发明在壮苗和生根采用了不同的培养基，先获得红花荷的芽，然后将芽接入壮苗培养基中获得较大的品质好的苗，再将小苗接入生根培养基中，这样做可以大大提高红花荷苗的生根率和成活率；

18、6)本发明采用低氮培养基，大大降低了红花荷玻璃化苗；

19、7)本发明额外添加了叶酸、苹果酸、酪氨酸，大大增加了外植体芽产生的几率；其中，苹果酸属于还原剂而且是植物三羧酸循环中的重要成分，苹果酸的添加首先可以抑制外植体的褐化，其次可以加快外植体的生理活动；氨基酸属于含氮化合物，酪氨酸的添加有利于芽的产生；叶酸有助于苗的生长。