一种快速诱导桫椤丛生芽的方法

本发明属蕨类植物不完全组织培养领域，具体涉及一种快速诱导桫椤丛生芽的方法。

背景技术：

1、桫椤(alsophila spinulosa)，属桫椤科(cyatheaceae)、桫椤属(alsophila)，国家二级保护植物、现存唯一的木本蕨类植物。主要生长于温暖潮湿的热带及亚热带地区，我国主要分布于贵州、重庆、四川等地。外形上，桫椤树形高雅飘逸、青翠碧绿、特别是排列整齐的孢子囊群是自然界的奇特境观。桫椤茎、叶含有丰富的黄酮、多酚、多糖、有机酸等活性物质，具有较高的观赏价值和药用价值，运用及开发潜力大。

2、桫椤的生活史是孢子体世代占优势的异性交替，孢子体世代与配子体世代均可独立成活。桫椤繁殖是由孢子萌发、配子体增殖、分化出孢子体，最后成为绿色植株。不管是野外播种、还是实验室土壤播种，桫椤孢子萌发在土壤基质里进行，会受到土层基质的菌类、藻类、苔藓类等竞争及化感作用，导致萌发率低以及不萌发的现象。故直接将孢子体的部分结构以及孢子作为外植体进行植物组织培养是繁殖桫椤的常规方法。以孢子体作为外殖体，发现桫椤的营养叶、幼茎可能是分生细胞的不丰富，也有可能是桫椤内生菌的原因，导致其在组织培养技术中难以形成愈伤组织或者ggb、丛生芽等结构，构建组培体系困难。而以孢子作为外殖体，桫椤繁殖包括孢子萌发诱导配子体、配子体增殖、分化孢子体、孢子体生根等过程。孢子的萌发需要在低糖、低无机盐的培养条件下进行；在配子体时期，成熟精子器与颈卵器需水作为媒介才能发生受精作用，受精成功后才能分化出孢子体。

3、通常以孢子作为外植体，采用ggb途径的构建的繁殖体系，包括孢子萌发诱导配子体、配子体诱导ggb、ggb分化、孢子体生根、桫椤再生苗炼苗、移栽等。而在有限的组培容器内,原叶体增殖密度高,可能会分泌较高浓度的成精子囊素,会抑制颈卵器的发生；其次组培容器里的湿度，水环境有限，难以发生受精作用，也会抑制了孢子体的形成。并且此过程桫椤繁殖体系的构建过程中程序过多，工作量大，还要历经孢子体生根、炼苗移栽等过程。

4、目前，经过检索未发现有相关报道对桫椤孢子进行不完全组织培养。本发明通过对桫椤孢子不完全组织培养，在短时间内获得大量的桫椤再生植株，以解决桫椤孢子组织培养过程繁琐，组培苗炼苗移栽时间长、工作量大以及孢子繁殖中孢子易与菌类、藻类、苔藓类竞争养分而降低发芽率及生长速率等问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一种快速诱导桫椤丛生芽的方法。该方法克服桫椤繁衍能力低，种群数量少，解决孢子繁殖周期长、效率低等技术问题。

2、本发明的技术方案：一种快速诱导桫椤丛生芽的方法，所述方法是先以桫椤孢子为外殖体消毒处理后进行萌发初代培养，再经过原叶体续代培养和配子体不完全培养，最后将桫椤孢子体丛生芽进行移栽。

3、前述方法包括以下步骤：

4、(1)桫椤孢子消毒处理：取成熟的桫椤孢子用10cm×10cm的滤纸完全包裹在蒸馏水浸泡10～15h，用灭菌后的烧杯在超净工作台上用30ml～60ml的75％酒精完全浸泡滤纸20～40s，无菌水清洗滤纸2～4次；再用30ml～60ml的5％naclo溶液完全浸泡滤纸3～5min后，无菌水清洗8～12次，最后打开滤纸，加入15～35ml无菌水制成无菌孢子悬浮液，即得a品；

5、(2)萌发初代培养：将a品接种于萌发初代培养基上，培养时间为2个月，得到蝶形原叶体，即b品；

6、(3)原叶体续代培养：将b品接种在原叶体续代培养基中增殖为原叶体团，培养1个月，得到原叶体团，即c品；

7、(4)配子体不完全培养：配子体不完全培养：将c品放入小型电动搅碎机里，以1000r/min的搅拌速率搅拌20～40s，搅碎成匀浆组织，与无菌水混合直接接种在土壤基质1上，每2～4天喷施无菌水一次，培养2个月后，匀浆组织再生形成配子体，配子体增殖，进一步分化形成孢子体，最后生成孢子体丛生芽，即d品；

8、所述土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝1～2.5:0.5～1.5:0.5～1.5；

9、(5)桫椤孢子体丛生芽移栽：将d品分株移栽在土壤基质2，培养1个月后，移栽到大棚进行常态化管理；

10、所述土壤基质2为红壤：腐殖土：泥炭土＝0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5。

11、前述步骤(1)中，桫椤孢子消毒处理：取成熟的桫椤孢子用10cm×10cm的滤纸完全包裹在蒸馏水浸泡12h，用灭菌后的烧杯在超净工作台上用40ml～50ml的75％酒精完全浸泡滤纸30s，无菌水清洗滤纸3次；再用40ml～50ml的5％naclo溶液完全浸泡滤纸4min后，无菌水清洗10次，最后打开滤纸，加入20～30ml无菌水制成无菌孢子悬浮液，即得a品。

12、前述步骤(2)中，培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2％，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000lux；

13、前述桫椤孢子萌发初代培养基为：1/8ms+0.5mg/l的6-ba+0.1mg/l的naa+20g/l蔗糖+10g/l琼脂，使用1mol/l的naoh和1mol/l的hcl调ph值至5.8。

14、具体的说，前述步骤(2)中，所述1/8ms的配比为大量元素:铁盐:微量元素:有机物＝0.125:1:1:1。

15、前述步骤(3)中，培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2％，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000lux；

16、前述原叶体续代培养基为：ms+20g/l蔗糖+6g/l琼脂，使用1mol/l的naoh和1mol/l的hcl调ph值至5.8。

17、前述步骤(4)中，配子体不完全培养：将c品放入小型电动搅碎机里，以1000r/min的搅拌速率搅拌30s，搅碎成匀浆组织，与无菌水混合直接接种在土壤基质1上，每3天喷施无菌水一次，培养2个月后，匀浆组织再生形成配子体，配子体增殖，进一步分化形成孢子体，最后生成孢子体丛生芽，即d品。

18、前述步骤(4)中，培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2％，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000lux；

19、前述土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝2:1:1。

20、前述步骤(5)中，培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2％，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000lux；

21、前述土壤基质2为红壤：腐殖土：泥炭土＝1:1:1。

22、本发明与现有技术比较，具有以下优点：

23、1、增加桫椤繁殖方式以及提高桫椤的繁殖效率。桫椤的匀浆组织再生，配子体的增殖率为100％，孢子体的分化率100％，形成大量的桫椤丛生芽。本发明实现了桫椤扩繁的高效增殖。

24、2、相比与桫椤组培繁殖的建立，不完全组织培养建立桫椤繁殖，周期上大幅度缩短。加快了桫椤的产苗时间。在土壤基质生长的丛生芽在没有激素的调控下可以直接进行生根诱导。可以直接对其进行分株移栽。节约实验成本，缩短实验周期。

25、3、突破了桫椤配子体受精、孢子体诱导、孢子体生根、再生植株炼苗的困难，显著提高桫椤的出苗率。对实现珍稀濒危蕨类植物桫椤扩繁、种质资源离体保存具有重要意义，为规模生产及应用奠定基础。