血液样本保存液及其制备方法和应用与流程

本技术属于生物医学，尤其涉及一种血液样本保存液及其制备方法和应用。

背景技术：

1、近十几年来恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈持续上升态势。传统的肿瘤筛查诊断方法如组织活检，由于检测效果有限，取样困难等多方面原因，无法有效灵活的对肿瘤的发展过程进行全程的监控。循环肿瘤细胞(ctcs)是一种从原发或转移肿瘤脱落到外周血中的癌细胞，这些细胞的数量和表型可以为癌症的预后和治疗提供重要的信息。然而，ctcs在血液中含量极为稀少，一般1ml血液中只有几个ctcs并包含数百万个白细胞以及数十亿个红细胞，这为ctcs的分离与分析带来了巨大的挑战。

2、传统的采血管并不能长时间保存ctcs，在长时间的运输过程中，ctcs会逐渐衰减，血液也会出现凝血或溶血现象，这进一步为ctcs的检测带来了困难。为了最大程度地保存ctcs的数量，降低储存和运输成本，在应用过程中需要特殊的保存液发挥下述作用：1、保持循环肿瘤细胞数量与完整性，使得下游检测可以得到最准确的结果；2、减少血液中出现的红细胞或血小板的聚集，防止在收集循环肿瘤细胞时影响收集效率。

3、目前，市面上使用较多的采血管包括乙二胺四乙酸(edta)抗凝管、枸橼酸-枸橼酸葡萄糖(acd)抗凝管，但是这两种采血管中ctcs均会随保存时间，数量不断衰减。cellsave和streck采血管虽然可以较好的维持ctcs在血液中的稳定性，但是这些血液管保存的全血通常在采血24h内就发生较为严重的凝血，无法用于样本的长时间保存，不利于中长途运输。故而急需一种采血管，能长时间存储血液样本，保持较好的血液状态，减少凝血，且在这个过程中ctcs也要保持较好的状态，以提高后续筛分效果。

技术实现思路

1、本技术的目的在于提供一种血液样本保存液及其制备方法和应用，旨在一定程度上解决现有血液样本中ctcs不能长时间保存，在长时间存储过程中ctcs会衰减，血液也会出现凝血或溶血现象的问题。

2、为实现上述申请目的，本技术采用的技术方案如下：

3、第一方面，本技术提供一种血液样本保存液，所述血液样本保存液包括组分：抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂，其中，所述膜蛋白保护剂包括细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂、蛋白酶抑制剂的至少一种。

4、在一些可能的实现方式中，所述细胞膜保护剂包括聚乙二醇、山梨醇、邻苯二甲酸二辛酯、聚乙烯乙二醇中的至少一种。

5、在一些可能的实现方式中，所述代谢酶抑制剂包括氟化钠、甘油醛中的至少一种。

6、在一些可能的实现方式中，所述蛋白酶抑制剂包括4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂中的至少一种。

7、在一些可能的实现方式中，所述抗凝剂包括edta钠盐、edta钾盐、枸橼酸、枸橼酸纳、乙二胺四乙酸中的至少一种。

8、在一些可能的实现方式中，所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮烷基脲、二唑烷基脲中的至少一种。

9、在一些可能的实现方式中，所述游离醛淬灭剂包括甘氨酸。

10、在一些可能的实现方式中，所述血小板凝集抑制剂包括替罗非班、乙酰基水盐酸、茶碱、腺苷中的至少一种。

11、在一些可能的实现方式中，所述血液样本保存液中溶剂包括生理盐水。

12、在一些可能的实现方式中，所述血液样本保存液与待保存样品的体积比为1：(5～20)。

13、在一些可能的实现方式中，所述血液样本保存液与所述待保存样品混合后，所述抗凝剂的浓度为1mg/ml～5mg/ml，所述防腐剂的浓度为5mg/ml～20mg/ml，所述游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/ml～5mg/ml，所述血小板凝集抑制剂的浓度为10μg/ml～100μg/ml，所述膜蛋白保护剂的浓度为0.1mg/ml～20mg/ml。

14、在一些可能的实现方式中，所述血液样本保存液中，所述膜蛋白保护剂至少具有如下任一特征：

15、所述细胞膜保护剂的浓度为0.05mg/ml～0.5mg/ml；

16、所述代谢酶抑制剂的浓度为0.1mg/ml～1mg/ml；

17、所述蛋白酶抑制剂的浓度为0.01mg/ml～0.1mg/ml。

18、第二方面，本技术提供一种上述的血液样本保存液的制备方法，包括步骤：将抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂溶解在溶剂中，得到血液样本保存液；其中，所述膜蛋白保护剂包括细胞膜保护剂、代谢酶抑制剂、蛋白酶抑制剂的至少一种。

19、在一些可能的实现方式中，所述溶剂包括生理盐水。

20、在一些可能的实现方式中，述血液样本保存液与待保存样品混合后，所述抗凝剂的浓度为1mg/ml～5mg/ml，所述防腐剂的浓度为5mg/ml～20mg/ml，所述游离醛淬灭剂的浓度为0.5mg/ml～5mg/ml，所述血小板凝集抑制剂的浓度为10μg/ml～100μg/ml，所述膜蛋白保护剂的浓度为0.1mg/ml～20mg/ml；其中，所述膜蛋白保护剂中，所述细胞膜保护剂的浓度为0.05mg/ml～0.5mg/ml；和/或，所述代谢酶抑制剂的浓度为0.1mg/ml～1mg/ml；和/或，所述蛋白酶抑制剂的浓度为0.01mg/ml～0.1mg/ml。

21、第三方面，本技术提供一种上述的血液样本保存液，上述方法制备的血液样本保存液在循环肿瘤细胞保存中的应用。

22、本技术第一方面提供的血液样本保存液中，抗凝剂能够阻止血液凝固，防腐剂能够稳定细胞形态，游离醛淬灭剂能够淬灭游离醛基，血小板凝集抑制剂能够抑制血小板凝集。膜蛋白保护剂中包括的细胞膜保护剂能够保护细胞膜及其上的蛋白位点，提高检验准确度，代谢酶抑制剂能够降低或抑制细胞自身代谢，防止因自身代谢等内部因素导致的细胞损失影响检测结果，蛋白酶抑制剂能够降低蛋白酶的活力，但不会使蛋白酶变性，使细胞表面的蛋白位点完整保存，提高检测准确性。通过血液样本保存液中各组分的共同作用，能够保持血液样本中细胞数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对待测细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。血液样本保存48h后仍能保持较好状态，不影响后续筛分。

23、本技术第二方面提供的血液样本保存液的制备方法，将抗凝剂、防腐剂、游离醛淬灭剂、血小板凝集抑制剂和膜蛋白保护剂溶解在溶剂中，便能得到血液样本保存液。制备方法简单，适用于工业化大规模生产和应用。通过血液样本保存液中各组分的共同作用，能够保持血液样本中细胞数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对待测细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。

24、本技术第三方面提供的应用，将上述血液样本保存液应用到循环肿瘤细胞保存中，通过血液样本保存液中各组分的共同作用，能够保持血液样本中循环肿瘤细胞(ctcs)数量与完整性，同时可以减少血液中出现的红细胞和血小板的聚集，有利于后续对循环肿瘤细胞的收集和检测，使得下游检测可以得到最准确的结果。血液样本在保存液中保存的48h内ctcs均呈现稳定状态，ctcs无衰减，ctcs表面蛋白位点保存完整，上皮细胞黏附分子(epcam)信号与0h时保持同等水平。