一种性状可动态调控的含根瘤菌蚕丝蛋白种子包衣剂的制作方法

本发明属于蚕丝蛋白(包括丝胶蛋白与丝素蛋白)的农业生物应用领域，具体涉及了一种性状可动态调控的含根瘤菌蚕丝蛋白种子包衣剂。

背景技术：

1、含根瘤菌的种子包衣剂是一种利用特定载体材料将根瘤菌与种子结合，使根瘤菌均匀地附着在种子表面的生物制剂。通过将根瘤菌引入到种子表面，可以在播种后有效地将根瘤菌传播到土壤和植物根部，从而实现与植物共生固氮的目的。含根瘤菌的种子包衣剂的好处主要包括：(1)固氮作用：根瘤菌与植物根部共生，将大气中的氮气转化为植物可利用的氮化物，提高作物对氮素的利用率，降低化肥使用量。(2)提高种子发芽率和幼苗生长速度：根瘤菌的存在有助于促进种子发芽和幼苗生长，进而提高作物产量。(3)增强作物抗逆性：根瘤菌可以改善植物的抗旱、抗寒等逆境能力，有利于作物在恶劣环境下的生长。(4)维护土壤生态平衡：由于根瘤菌的生物固氮作用，可以减少化肥使用，减轻化肥对环境的负担，有助于维护土壤生态平衡。(5)环保：相较于化学合成种子包衣剂，含根瘤菌的种子包衣剂更具环保性，对环境和人体健康的影响较小。

2、目前已有的含根瘤菌的种子包衣剂主要包括以下几种：(1)藻酸钠-根瘤菌种子包衣剂：藻酸钠作为一种天然的多糖，具有良好的生物相容性和降解性。藻酸钠可以作为载体，与根瘤菌一起制成种子包衣剂。这种包衣剂在提高根瘤菌在种子表面的存活率的同时，可以提高作物的抗逆性。(2)壳聚糖-根瘤菌种子包衣剂：壳聚糖具有优良的生物降解性、生物相容性和抗菌性。壳聚糖-根瘤菌种子包衣剂能够提高根瘤菌在种子表面的存活率，同时具有一定的抗病性。(3)丝蛋白-根瘤菌种子包衣剂：丝蛋白作为一种生物材料，具有优良的生物相容性、降解性和力学性能。丝蛋白-根瘤菌种子包衣剂能够提高根瘤菌在种子表面的存活率和感染率，从而提高固氮效果。(4)水凝胶-根瘤菌种子包衣剂：利用水凝胶作为载体，可以将根瘤菌均匀分布在种子表面。这种包衣剂具有良好的保水性能，有助于提高作物在干旱条件下的抗逆性。(5)聚合物-根瘤菌种子包衣剂：聚合物可以作为根瘤菌的载体，如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠等。这些聚合物具有良好的生物相容性，可以提高根瘤菌在种子表面的存活率。(6)微胶囊-根瘤菌种子包衣剂：通过微胶囊技术，将根瘤菌包裹在微胶囊中，使其在种子表面形成均匀的保护层。微胶囊-根瘤菌种子包衣剂具有较高的包覆效果，能够提高根瘤菌的存活率和感染率。

3、但是这些含根瘤菌的种子包衣剂存在一个普遍的缺点，即缺乏对于包衣层结构和形状有效地控制。例如以水凝胶和微胶囊为载体的根瘤菌种子包衣剂缺乏储存的稳定性，需要现配现用，这显著增加的加工成本，并且让各种子批次的稳定性难以控制。此外，海藻酸、壳聚糖、聚合物以及已报道的丝蛋白的含根瘤菌的种子包衣剂的性状都无法有效动态调控。这在很大程度上限制了含根瘤菌种子包衣剂的作用发挥。因此，上述已见报道的含根瘤菌的种子包衣剂还存在诸多问题。例如，在不同气候和土壤条件下的适应性问题。由于这些包衣剂的物理性能无法调控，因此根瘤菌种子包衣剂无法保证在不同的气候环境条件下(如寒冷、干旱等)，以及不同的土壤环境下(沙地、高湿土壤以及盐碱土壤等)下均能具有有效地发挥包衣作用。此外，在不同环境条件下根瘤菌存活率和感染率都会有显著的差异，包衣剂形状的不可调控性也使得在不同条件下的固氮作用变得难以控制。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种性状可动态调控的含根瘤菌蚕丝蛋白种子包衣剂，针对现有技术中的缺陷，使用离子与丝蛋白动态螯合作用调控丝蛋白网络结构及含水率，从而来动态调控其包载根瘤菌的种子包衣剂的物理性质(包括，力学性能、溶胀性和环境降解速率)。

2、为了解决上述技术问题，采用如下技术方案：

3、一种性状可动态调控的含根瘤菌蚕丝蛋白种子包衣剂，其特征在于采用如下步骤制备：

4、(1)配置丝蛋白溶液；

5、(2)在所述步骤(1)的丝蛋白溶液中加入高吸湿性盐或无机肥料，获得丝蛋白离子溶液；

6、(3)在所述步骤(2)处理后的丝蛋白离子溶液中加入根瘤菌悬浮液，搅拌均匀后制得含根瘤菌丝蛋白种子包衣剂。

7、优选后，所述丝蛋白溶液的浓度范围为0.1wt％-10wt％。根据实际需求，可在该浓度范围内调节丝蛋白溶液的浓度。

8、优选后，所述丝蛋白溶液在制备过程，缩减其溶解的透析时间，缩短至原有透析时间的1/3-2/3。通过缩减透析时间，可保留部分盐在丝蛋白溶液中。同样的，可以按照丝蛋白溶解的常规操作方法(如三元溶剂法)获得丝蛋白水溶液。

9、优选后，所述步骤(2)高吸湿性盐或无机肥料为尿素、硫酸铵、磷酸钙、磷矿粉、氯化钾、硫酸钾、氯化钠、碳酸钙、氯化钙、氢氧化钙、硫酸钙和碳酸钠中的一种或两种及以上的复配。这些盐可以单独添加也可以采用复配工艺添加。

10、优选后，所述步骤(2)丝蛋白与盐在溶液中的固含量之比为20:1-50:1。

11、优选后，所述步骤(3)根瘤菌悬浮液的浓度为1×108cfu/ml。

12、优选后，所述步骤(3)丝蛋白溶液与根瘤菌悬浮液按体积比1∶1或2∶1混合，混合后充分搅拌。

13、优选后，所述含根瘤菌丝蛋白种子包衣剂中添加其他种子包衣剂进行复配。

14、优选后，其他种子包衣剂为精甲霜灵、咯菌腈、噻虫嗪、苯醚甲环唑、吡虫啉、氟吡菌酰胺或戊唑醇中的一种或两种及以上。

15、优选后，所述含根瘤菌丝蛋白种子包衣剂中添加营养元素、生长激素、农药、生物农药与益生菌中的一种或两种及以上进行复配。

16、优选后，所述含根瘤菌丝蛋白种子包衣剂中添加填料，所述填料包括玉米淀粉或膨润土中的一种或两种，用于调控包衣剂的性能。

17、优选后，所述含根瘤菌丝蛋白种子包衣剂中添加助剂，所述助剂包括增稠剂或防腐剂中的一种或两种，用于调控包衣剂的性能。其中增稠剂可以为月桂醇、肉豆蔻醇、癸醇等；防腐剂可以为苯甲酸、山梨酸、丙酸钙等。

18、优选后，还包括有该含根瘤菌丝蛋白种子包衣剂的种子包衣步骤：

19、a、将含根瘤菌丝蛋白种子包衣剂均匀的包覆在种子上，干燥种子；

20、b、控制丝蛋白构象。

21、优选后，所述步骤a包覆过程：将含根瘤菌丝蛋白种子包衣剂放入包衣袋，向包衣袋中倒入种子并鼓入空气后封口，无固定方向摇晃包衣袋使该包衣剂均匀地包覆在种子上。其涂层厚度可以根据选用的丝蛋白的初始浓度进行调节。

22、优选后，该含根瘤菌丝蛋白种子包衣剂放入包衣袋后，控制在包衣袋下半部分，且该包衣剂均匀分散开，同时避免包衣剂扩散至包衣袋边缘。

23、优选后，所述步骤a干燥：将包覆完成后的种子倒入筛网，将水分晾干或者冷风/热风风干。

24、优选后，所述步骤b控制丝蛋白构象的第一种工艺，干燥后的种子转移到密闭的高湿、室温环境静置，调控丝蛋白β-折叠的含量在0-40％。在这个过程中盐的吸湿作用会使得水分子扩展进入丝蛋白网络，并诱导丝蛋白反正构象转变，从无归线团转变到β-折叠。在这个技术方案中，β-折叠的含量可以通过控制密闭环境的湿度以及静置的时间来调控，其可调控范围为0％-40％。

25、优选后，所述的高湿湿度为60-90％，静置时间为0.5-12h。

26、优选后，所述步骤b控制丝蛋白构象的第二种工艺，干燥的种子转移到密闭环境或者密封袋中，将环境温度从室温升高，并保温一定的时间，调控丝蛋白β-折叠的含量在0-40％。升高温度根据不同种子的特性进行优化选择，同样保温时间也可以根据食品的特性进行优化选择。通过控制这两个环境条件，也可以实现对种子包衣中丝蛋白β-折叠含量的有效控制，调控范围为0％-40％。

27、优选后，所述的升高温度为20-45℃，所述的保温时间为0.5-12h。

28、优选后，将步骤b处理后的种子在20-50％的低湿室温环境下静置0.5-6h，最后密封包装成品。

29、由于采用上述技术方案，具有以下有益效果：

30、1、本发明中的种子包衣层的厚度及其丝蛋白聚集体结构/力学特性可以精确控制，因此能够促进种子的萌发和生长，并且能够控制包衣剂中的根瘤菌和营养物质的释放速率。

31、2、本发明中的种子包衣中所含的金属离子元素如钠、钾、钙一方面能与丝蛋白形成螯合结构，其次能够从土壤环境中，汲取水分，形成水合结构。这个结构不仅能够显著增塑在干旱条件下丝蛋白的网络结构，避免了种子包衣剂在干旱环境条件下的脆化崩解，而且能够将水分固定在种子包衣剂的网络中，为根瘤菌的生长提供理想环境。另一方面，由于经过诱导构象转变处理后，除了离子螯合形成的分子网络连接以外，形成的β-折叠结构能够在高湿环境下稳定润涨的包子包衣膜，避免了种子包衣膜在高湿土壤环境中的瞬间崩解，导致根瘤菌的流失。因此，无论是在干燥或者湿润环境，本发明的种子包衣都能提供稳定的结构和物理性质，并且在各种土壤环境都能够保证包衣有适宜根瘤菌生长的水环境。

32、3、种子包衣的主要成分为蛋白质和无机盐，所有组分均生物相容，不会污染土壤环境，也不会导致土壤质量下降。甚至丝蛋白在降解后能够提供氮肥元素。此外，上述成分也不会影响作物对病虫害的抗性和适应性。整个生产工艺也不会产生环境污染问题。

33、4、本发明中的种子包衣属于广谱种子包衣剂，即适用于不同种子，例如小麦、谷物、玉米、大豆等粮食作物，以及鲜花，绿植等观赏性和稀缺植物种子等。

34、5、使用普通的根瘤菌种子包衣剂作为对照组进行处理，种植实验结果显示，本发明的种子包衣剂剂在出苗(出苗时间、出苗率)、ce(株高、根部生长量)、和抗旱(作物长势、叶色和存活率)、抗逆性和氮素利用率等指标上，均显著高于对照组。