基于两步法构建的父源性骨关节炎动物模型的构建方法及其应用

本发明涉及动物模型构建，具体涉及一种基于两步法构建的父源性骨关节炎动物模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、骨关节炎是一种好发于老年人的慢性退行性关节疾病，主要以关节软骨退变、骨赘形成、软骨下骨硬化和滑膜炎症为特点。骨关节炎也是引起老年人关节疼痛、慢性致残的首要原因，其患病率随年龄递增，65岁以上人群甚至已高达50％。伊朗学者safiri及其同事通过分析2017年全球疾病负担研究中关于1990年到2017年全球多个国家和地区的骨关节炎负担，发现2017年骨关节炎的年发病率比1990年增加了8.2％。而根据2020年发表在《柳叶刀(lancet)》上的评论指出骨关节炎发病率占全球总人口数的7％，约超过5亿人受到影响。骨关节炎不仅严重影响患者个体的生活质量，还给社会带来沉重的经济负担。在发达国家，骨关节炎所占用的医疗消耗可高达gdp总值的1％～2.5％。此外，骨关节炎还被美国食品药品监督管理局列为是一种“医疗需求未得到满足的严重疾病”[1]。因此，骨关节炎的防治是全球公共卫生领域所面临的重大挑战。当前迫切需要明了驱动骨关节炎发生的病理生理机制，以便实现早期预防及诊断，从而筛选出更优的个体化治疗手段。

2、近年来，“健康与疾病的发育起源(developmental origins of health anddisease,dohad)”学说受到广泛关注，越来越多的证据支骨关节炎具有发育起源。研究发现，父体不良环境可以诱发子代出现不良妊娠结局(如宫内发育迟缓等)，并引起子代成年后多疾病易感以及多代遗传效应。例如，父体饮酒会引起子代发育迟缓，并导致子代空间学习障碍；父体尼古丁暴露可以导致子代代谢功能的改变，并增加子代肝纤维化发生的风险；父体不良营养状态和饮食习惯可导致子代糖耐量异常，并增加子代患肥胖症和心血管疾病的风险，且可以持续影响超过三代人。此外，父体的不良环境暴露同样也可以导致子代对骨关节炎的敏感性。研究发现，骨关节炎具有父体起源，高脂饮食喂养的雄性小鼠，其f1代和f2代雌性小鼠对创伤诱导的骨关节炎易感性升高，并表现出骨微结构的变化，即父源性骨关节的发生[2]。以上均提示，因为精子发生过程中不良环境是导致父源性骨关节炎易感的重要危险因素。因此，探究父体育龄期不良环境因素对骨关节炎发生的作用，合理规避精子发生过程暴露不良环境中，对指导优生优育，提高人口质量具有重要的现实指导意义。

3、对骨关节炎的发生及发展的研究中，与人类骨关节炎具有相似表现的动物模式具有非常重要的意义。目前的实验动物模型中，主要包括类创伤性关节炎手术造模，如：内侧半月板切除手术；类软骨破坏化学造模，如：木瓜蛋白酶关节腔注射等；退运性关节炎造模：下肢石膏外固定等，其主要针对于成年动物关节腔内物理、化学或生物的方式破坏关节内结构并导致关节软骨退行性改变，但骨关节炎的发育起源及父源性骨关节炎的发生、发展改变的研究模型仍是盲点及痛点。除此之外，这些造模方法虽能模拟骨关节炎发生的疾病表型，但疾病表型仅存在于关节腔局部，无法探究骨关节炎与全身代谢的关系[3]。同时，此类动物造模的时间为出生后个体而非由父体原因影响精子发生过程介导的骨关节炎，因而只能反映出生后的“第二次打击”造成的对关节腔内组织的损伤，忽略了骨关节炎的发育起源的影响，与父源性骨关节炎发病机制方面存在较大的差异。因此，现有研究迫切需要建立同时诱导出高发的父源性骨关节炎动物模型，与人类骨关节炎高度相似，进一步探究其发病机制、早期预警与防治，从而造福人类。

4、关节软骨主要在胚胎时期形成，在生命早期关节软骨细胞的增殖分化对晚期关节的代谢稳态具有决定性作用。随着年龄的增长，关节局部缺乏血管支配，软骨细胞数目及关节软骨质量逐渐下降，损伤的关节软骨逐渐无法自我修复，表为出关节退行性改变。因此，成年后骨关节炎的发生与宫内时期软骨细胞的发生与分化具有密切的关系。软骨细胞的肥大分化是最常见的异常分化，宫内时期的软骨细胞肥大分化可以导致出生后关节软骨细胞外基质降解增加，进而诱导骨关节炎的发生[4]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，mapk)信号通路在关节软骨的增殖、分化、转化和表型维持中具有重要的意义。在成人骨关节炎汇总mapk信号通路的激活可以导致软骨细胞细胞外基质降解增加，而宫内及幼年时期mapk信号通路则介导了软骨细胞的肥大分化。在既往的研究中提示，mapk在它们的碱形式中是没有催化活性的。为了变得活跃，它们需要它们的活化环中发生多个磷酸化事件。因此，在关节软骨发育及骨关节炎发生、发展中mapk信号通路的磷酸化水平起到重要的作用。

5、咖啡因是一种黄嘌呤生物碱，广泛存在于各类软饮中，是世界上普遍被使用的精神活性药物。据估计全球每天大约有80％的人消费含咖啡因的食品。近年来，全球咖啡消费量日益增加，生育期男性长期处于咖啡因暴露的环境。调查数据显示，育龄期男性咖啡因平均摄入量为240mg/d，约为女性的1.5倍[5]。本发明构建了日常生活环境可达到的父体孕前咖啡因暴露(paternal pre-pregnant caffeine exposure，ppce)，暴露时间2月(覆盖雄鼠整个生精周期)，之后与正常雌鼠交配获得仔鼠。本发明观察到ppce可致胎鼠体型变小、体重与体长显著降低，宫内发育迟缓发生率显著升高等表现，表明ppce可构建稳定子代低出生体重模型。提示，ppce与父源性骨关节炎的发生密切相关。

6、主要参考文献：

7、1.latourte a,kloppenburg m,richette p:emerging pharmaceuticaltherapies forosteoarthritis.nat rev rheumatol 2020,16(12):673-688.

8、2.harasymowicz ns,choi yr,wu cl,iannucci l,tang rh,guilak f:

9、intergenerational transmission of diet-induced obesity,metabolicimbalance,andosteoarthritis in mice.arthritis rheumatol 2020,72(4):632-644.

10、3.van der kraan pm:factors that influence outcome in experimentalosteoarthritis.

11、osteoarthr cartilage 2017,25(3):369-375.

12、4.kozhemyakina e,lassar ab,zelzer e:a pathway to bone:signalingmoleculesand transcription factors involved in chondrocyte development andmaturation.

13、development 2015,142(5):817-831.

14、5.yeshurun s,rogers j,short ak,renoir t,pang ty,hannan aj:elevatedpaternal glucocorticoid exposure modifies memory retention in femaleoffspring.

15、psychoneuroendocrino 2017,83:9-18.

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种成功率高、有效可靠、可重复性强、简便易行的父源性骨关节炎动物模型的构建方法。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种基于两步法构建的父源性骨关节炎症动物模型的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：

4、s1：选取健康育龄期的啮齿类动物，在受孕前8周的时间段(覆盖一个完成生精周期)，每日给予60mg/kg咖啡因胃內灌注，雄鼠自由饮食，与正常雌性大鼠获得孕鼠；

5、s2：孕鼠自然生产，获得子代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时选取窝仔数为12～14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各6只进行哺乳喂养；

6、s3：仔鼠出生后4周断奶并雄、雌分笼，部分继续正常饮食饲养至出生后28周；

7、s4：部分子代饲养至出生后28周，再给予4周中度跑步(以18m/min恒定速度持续30分钟，每周3次)。在32周检测骨关节炎相关指征来综合判定骨关节炎发生；最终得到父源性骨关节炎动物模型。

8、作为优选方案，所述步骤s1中，啮齿类动物为spf级wistar、sd等大鼠或昆明、c57等小鼠以及豚鼠、地鼠等。

9、进一步地，所述步骤s3中，正常饮食是配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.3-2001》规定的小鼠、大鼠配方饲料相同。

10、更进一步地，所述步骤s4中，骨关节炎检测相关指标是：关节软骨形态学改变与骨关节炎评分。

11、第二方面，本发明提供父源性骨关节炎动物模型在筛选可导致仔鼠软骨发育毒性的父体育龄期不良环境干扰物中的应用，其特征在于：所述父源性骨关节炎动物模型由如以上任一构建方法得到。

12、第三方面，本发明提供父源性骨关节炎动物模型在筛选父源性骨关节炎早期预警及干预靶标中的应用，其特征在于：所述父源性骨关节炎动物模型由如以上任一构建方法得到。

13、第四方面，本发明提供父源性骨关节炎动物模型在筛选防治骨关节炎治疗药物的应用，其特征在于：所述父源性骨关节炎动物模型由如以上任一构建方法得到。

14、上述父源性骨关节炎动物模型还可以应用于研究骨关节炎发生机制方面。

15、本发明的技术原理及研究过程如下：

16、本发明对ppce(即第一次打击)子代动物，进行中等强度跑步或前交叉韧带离断等(即第二次打击)，检测骨关节炎相关形态学指标确定子代骨关节炎的发生、发展，两步法建立父源性骨关节炎动物模型。该模型模拟了来源于育龄期父体不良环境暴露导致的子代骨关节炎发生发展的疾病表型，对阐明父源性骨关节炎的发生发展机制，确定早期预警及防治具有重要意义。

17、本发明的优点及有益效果如下：

18、1.本发明主题新颖。咖啡因作为慢性应激源，更具有日常暴露的特性。建立孕前父体咖啡因暴露的动物模型更贴和日常生活，也更为合适、新颖。

19、2.本发明造模简单。育龄期给予咖啡因，与正常雌性交配获得子代，在子代出生后正常饲养至出生后28周予以第二次打击，采用关节软骨形态学改变与骨关节炎评分等指标能够观察骨关节炎的发生及进展情况。本模型指标稳定性好，可重复性强，为父源性骨关节炎动物的模型构建提供了一种可靠的方法。

20、3.本发明便于探究发病机制。基于本发明构建的父源性骨关节炎动物模型，可用于探讨父源性骨关节炎的发生发展机制。本动物模型相较传统骨关节炎动物模型更强调来源于育龄期父体不良环境暴露的第一次打击，对骨关节炎的发生机制可以进行更早时期的观察。

21、4.本发明便于寻求预警靶标。基于本发明构建的父源性骨关节炎动物模型，可用于探讨父源性骨关节炎的早期预警靶标。本动物模型相较传统骨关节炎动物模型，更强调发育过程中软骨质量的改变，进而导致成年个体骨关节炎的发生，在发育过程中寻求骨关节炎的早期预警靶标。

22、5.本发明便于发现干预靶标。基于本发明构建的父源性骨关节炎动物模型，可用于探讨父源性骨关节炎的早期干预靶标。本动物模型相较传统骨关节炎动物模型，更强调软骨功能改变由宫内持续至出生后改变，在发育过程中寻求骨关节炎的早期干预靶标。