本发明属于儿童疾病动物模型构建领域，具体涉及一种豚鼠近视模型的构建方法。
背景技术：
1、青少年近视已经成为日益严重的健康问题，了解近视的发病机制、影响因素等已尤为重要。近视眼是全球范围内严重危害视功能的主要眼病，近年来其发病率持续上升，尤其是青少年。近视眼的防治已经成为公共卫生的重要课题。近年来国内外学者们已对近视眼进行了广泛而深入的研究，研究范围涵盖了近视的动物模型建立、病因、发病机制、病理生理、分子生物学改变以及各种不同的治疗方法等。近视眼对眼底形态及视功能呈进行性损害，它的发生机制成为眼科的研究热点，动物模型的建立为一些受限于伦理和实验手段而无法进行的研究提供了良好的受试对象和实验平台。近年来，学者们采用鸡、小鼠、树`、豚鼠、兔、猴等动物模型，对远视性离焦和近视性离焦对幼年动物眼的影响，视觉发育的双向调节作用，昼夜节律、不同光谱对眼轴延长的影响，以及与眼轴延长相关的细胞因子等进行了大量研究。自从建立了第一个小鸡的近视动物模型以来，用于近视研究的实验动物种类也不断增多：鱼、兔、小鼠、豚鼠、树`、恒河猴等。周翔天等分析了鸡、树鼠、猴、小鼠、豚鼠制作近视动物模型的优缺点。吕梦等详细论述了几种常用近视实验动物的发育过程，眼球结构、成分和生理功能。各种近视模型所采用的动物都有其鲜明特征，研究者应该根据研究的特点选择合适的动物。从各方面比较来看，小鼠、豚鼠是经济而合适的近视动物模型；恒河猴眼球与人类相近而更加适合研究，但是存在价格昂贵、成本较高等缺点。豚鼠成为近几年建立近视模型最常用的动物。豚鼠生后即开眼，眼球解剖结构、视网膜细胞构成和正式化机制与人类基本相似；巩膜组织也在近视发生发展中细胞外基质降解；另外，其配合度高、饲养方便、价格合理。因此，豚鼠是一种诱导近视模型较为理想的动物。
2、动物模型对于研究近视的发生原因和过程提供了极有价值的途径。自1961年young报道缝合恒河猴的眼睑诱导近视以来，各国学者经过大量研究利用不同的动物模型进行了多方面探讨。目前，常用于近视研究的实验性近视模型是形觉剥夺模型和离焦模型，前者主要通过缝合眼睑诱导近视，后者则利用佩戴负透镜离焦获得近视。为了更能模拟人类，最理想的用于诱导近视的模型动物是灵长类，如恒河猴、猕猴等，有报道称广泛用于诱导近视的树鼠就其生物学特性来说也更接近于灵长类而非啮齿类，因此也是较理想的模型动物；此外，属于鸟类的幼`由于能在短时间内(7天)有效地诱导近视而被广泛地用于近视研究。建立理想近视动物模型是研究其发病机制不可缺少的工具，迄今已经成功建立了一些近视动物模型，诱导方法主要有形觉剥夺法、透镜诱导法、药物诱导法、视觉空间限制法等，其中最常用的是形觉剥夺法，通过眼睑缝合、遮盖等造成视力障碍，使物象不能清晰地聚焦于视网膜上而形成近视，能够较好地模拟人类近视的形成过程。但是眼睑缝合造成眼睑粘连，挤压角膜，从而引发感染等不良反应，同时容易导致角膜半径的改变及缝合线的脱落，且不易形成近视恢复模型。基于以上种种劣势，后期采用改良型形觉剥夺法建立模型，通过半透明膜罩(或弥散眼罩等)遮盖在眶周形成视觉成像障碍，此法有效弥补了眼睑缝合的缺点，利于近视恢复模型研究，是目前应用最广泛的模型。新出现的频闪光诱导光觉异常性近视模型，模拟一种实际生活中经常存在的光觉异常环境，通过人工照明环境中所出现的大量频闪光，由于强烈明暗对比，频闪过程中无形觉剥夺及色觉失衡因素，此模型的建立为研究近视的发病机制和病理变化提供了极具价值的途径和思路。
3、眼睑缝合法操作简单，但易被豚鼠破坏，存在感染风险，且压迫眼球可能影响其健康，有逐渐被淘汰的趋势；半透明膜法将半透明膜固定于眼周，操作简单，同样容易被豚鼠破坏；塑料眼罩法将特制的塑料眼罩缝合固定于豚鼠的诱导眼一侧，操作简单，但稳定性可能不高；项圈+眼罩法是目前应用比较多的方法，项圈可减少豚鼠对眼罩的破坏，但容易影响其进食饮水及精神状态；单纯眼罩法可将诱导镜片的圆形底座先固定在眼周，再将镜片固定在底座上，置于眼前，操作简单，但易被破坏；屈光手术法理论可行，尚未见相关的研究论文报道。头架+眼罩法实现了模型制作时不直接接触豚鼠眼球或眼周组织，可根据不同鼠龄调整遮眼镜框位置，能方便地对眼球进行操作和测量，利于眼部健康的维护。但该方法也存在明显的缺点：1)手术操作复杂，技术难度高，对豚鼠创伤人；2)诱导装置复杂且成本高，仅能在少数有条件的实验室开展；3)头顶固定装置对局部组织的影响大，脱落后再次造模的可能性小。
4、建立豚鼠近视模型的方法各具优缺点，常用的fd(面罩遮盖)和光学离焦(负透镜诱导)方法简单易行，持有乳胶气球或负镜片即可，但是造模过程中容易出现面罩或镜片滑落的情况，因此需要经常观察面罩或镜片的位置及松紧度，一旦滑落则需要重新将面罩或镜片戴在豚鼠头上，滑落时间过长甚至需要淘汰该实验豚鼠。闪烁光、色觉失衡及光强等诱导形成近视相交于前两种造模方法而言成功率较低，涉及到的因素较多，例如光的频率大小、波长长短及光强大小的选择等，但是不同的近视模型代表的近视诱因不同，都用统一近视模型可能导致实验结果出现偏差。总之，目前豚鼠近视模型的诱导方法很多，各有利弊，综合来看，目前豚鼠近视模型的制作尚缺乏一种既稳定、安全、经济又微创的方法。
技术实现思路
1、本发明旨在尽可能克服目前豚鼠近视诱导模型的缺点，开发一种能够重点针对青少年近视的核心症状，能够很好的进行近视的干预和防控评价的动物模型。本发明为近视眼的防治提供了可靠、可控的动物模型，且操作过程易复制、数据易获取，操作简单，具有成本较低、模型稳定、操作简便、无创伤等优点，为临床上实现近视的防控和早期干预提供了新思路和实验基础。
2、本发明是通过以下技术方案实现的：一种豚鼠近视模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3、(1)、适应性饲养：选择2周龄体重100-150g的清洁级英国短毛种三色豚鼠，实验前检查所有豚鼠身体健康，眼部无特殊疾患，双眼屈光均为远视且无明显屈光参差(双眼屈光度差值小于2.50d)。饲养环境安静，室温恒定约25℃，自由进食饮水并每日给予两次新鲜绿色蔬菜补充维生素c：实验动物按3r原则给予人道关怀：适应性饲养两周，造模周期为8周。
4、(2)、高氧诱导：适应性饲养两周后，将豚鼠置于密闭氧箱中1周(该阶段为第1周)，所述密闭氧箱的氧浓度维持在55％左右。
5、(3)、食物诱导：1周后，将豚鼠从密闭氧箱中取出。先正常饲养1周(该阶段为第2周)，然后从第3周开始，给豚鼠改喂高糖高蛋白饲料，所述高糖高蛋白饲料为常规饲料添加质量为常规饲料20％的蔗糖和20％的鱼粉并均匀搅拌而成；每天投喂三次。
6、(4)、药液刺激：从第4周开始，采用滴眼液给药方式给予链脲霉素和碘乙酸钠的混合液，每天给药一次，所述混合液中链脲霉素的含量为0.2mg/ml，碘乙酸钠的含量为0.1mg/ml；所述混合液由链脲霉素和碘乙酸钠溶于生理盐水制备而成。
7、(5)、明暗刺激：第5-6周，每天给予豚鼠明暗刺激，每天进行2小时的光照和2小时的黑暗环境循环。
8、(6)、强光刺激：第7-8周，每天给予豚鼠10000lux的强光刺激1小时；为期两周后，即得豚鼠近视模型。
9、8周建模结束后，通过观察豚鼠行为学及体重变化、检影验光、眼部a型超声测量、眼底照相及荧光造影、he染色光镜检测视网膜形态学变化、血清炎症因子水平检测、免疫组织化学检测视网膜内tgf-β2表达，结果表明，兔子出现了典型的近视症状，符合近视动物模型可靠性和有效性的判定，即疾病的发病原因、症状表现、病理生理，按照本发明的构建方法，能够成功获得豚鼠近视模型。
10、本发明的技术方案，具有如下优点：
11、1、本发明的豚鼠近视模型的构建方法中，通对动物高氧+高糖高蛋白饲料+滴注链脲霉素和碘乙酸钠混合液+明暗刺激+强光刺激得到豚鼠近视模型，这种非单因素诱导的豚鼠近视模型与病因学上认为近视是多因素诱导发生相符，能够更好地模拟人类近视的特征。本发明非单因素诱导的豚鼠近视模型，基本上符合三种有效性，无论是从病理生理理论角度，还是模拟典型临床症状和治疗预测角度，都是较为理想的动物模型，将为近视的多因素诱导发病机制提供支持，并为开发近视防治的新方案提供理论依据。
12、2、本发明构建的豚鼠近视模型效果稳定，个体差异小；多因素之间相互协同，构建的疾病模型更为准确。该模型在近视经典症状(屈光度变化、璃体腔加深、眼轴增长、眼底暗红、后极部各层变薄等)上均表现出较高的成功率和稳定性。
13、3、本发明的豚鼠近视模型，为非单因素诱导的豚鼠近视模型，将为近视的多因素诱导发病机制提供支持，以及更好地模拟人类近视的优势，为开发一种有效防治近视的新途径提供重要的理论依据。不但可用于探究多因素对近视的科学内涵，还能对防治新途径的筛选提供能反应疾病本质的动物模型。
14、4、本发明采用了高氧+高糖高蛋白饲料+滴注链脲霉素和碘乙酸钠混合液相结合的近视诱导方式。(1)高氧条件可刺激豚鼠的视网膜毛细血管发生病理变化。(2)研究人员经多次试验发现，富含蔗糖和鱼粉的高糖高蛋白饲料可诱导豚鼠眼球局部结构及生理状态发生变化，经试验人员无数次创造性的劳动，筛选出了“常规饲料添加质量为常规饲料20％的蔗糖和20％的鱼粉”的高糖高蛋白饲料，该饲料配方极利于诱导豚鼠近视的发生。(3)链脲霉素和碘乙酸钠都属于炎症诱导剂，为了加剧豚鼠眼部炎症反应，从而有利于近视模型的诱导，研究人员经多次试验发现，滴眼液给药方式给予链脲霉素和碘乙酸钠的混合液能够极佳的促进豚鼠视网膜发生病理变化，促进诱导豚鼠近视的发生，链脲霉素和碘乙酸钠在给药诱导过程中可协同作用，大大优于单剂的诱导效果；同时合适的给药剂量也能在保证诱导效果的同时避免对豚鼠眼部的过度伤害，申请人通过大量试验，优化了混合液的配比：混合液中链脲霉素的含量为0.2mg/ml，碘乙酸钠的含量为0.1mg/ml，保证了豚鼠近视模型构建的安全性和稳定性。(4)本发明的豚鼠近视模型构建方法，先采用高氧诱导，使得豚鼠的视网膜毛细血管在一定程度上发生病理变化，进而饲喂高糖高蛋白饲料，加剧视网膜毛细血管病变的同时，进一步诱导豚鼠眼球局部结构及生理状态变化，然后再滴注链脲霉素和碘乙酸钠混合液，承前启后，进一步激活豚鼠眼球炎症通路、诱导炎症发生，三个步骤层层递进、协同结合、前呼后应，大大利于豚鼠近视的诱导发生。
15、5、本发明同时还采用了明暗刺激+强光刺激的诱导方法，能够更好的模拟中医临床近视病因、病症，同时高氧+高糖高蛋白饲料+滴注药液相结合，能够极佳的诱发近视经典症状。两周连续循环的明暗刺激，降低了豚鼠眼部的免疫力和抵抗力，紧接着的强光刺激可较大程度上加剧豚鼠视网膜、巩膜、脉络膜的病理变化、在前期高氧+高糖高蛋白饲料+滴注药液诱导的基础上，后期的明暗刺激和强光刺激可进一步提高豚鼠眼部的敏感性和加剧病理反应，保证了效果稳定的豚鼠近视模型。
16、本研究可为深入解析人类患近视后的眼部免疫机制以及评价干预和防治近视的新方法提供良好的理论支撑和模型参考。研究团队对该模型进行了多次重复验证，结果可靠，并已利用该模型对多种药物和防治途径进行了评价，验证了模型的应用价值。本研究可为近视新药和防治途径的评价提供可靠的动物模型，其具有成本较低、模型稳定、操作简便、无创伤等优点。