CRBN基因人源化动物模型及构建系统、构建方法及应用

本发明涉及动物基因工程，具体涉及crbn基因人源化动物模型及构建系统、构建方法及应用。

背景技术：

1、免疫调节药物沙利度胺和相关化合物目前唯一已知的分子靶点是cereblon(crbn)。然而，沙利度胺和相关化合物在小鼠模型中缺乏活性，导致小鼠crbn无法响应。近年研究表明，小鼠crbn基因中第391位的异亮氨酸突变为氨酸使得小鼠crbn表现出在人类细胞中鉴定的沙利度胺诱导药物靶标的降解。建立crbn基因人源化动物模型，是免疫研究的迫切需求。ncf1基因的单核苷酸多态性在小鼠慢性炎症性自身免疫性疾病中具有重要作用，其活性氧缺失可引发自身免疫反应增强乃至患者病情加重。该效应在许多不同的小鼠疾病中起作用，如狼疮，系统性硬化症和银屑病。在ncf1基因调控的下游信号通路，包括巨噬细胞和stat1基因。

2、基因人源化动物模型是利用基因技术将人类基因插入动物基因组，使其携带人源基因的动物模型。小鼠与功能性基因极少表现出完全相同，导致人体和小鼠结果存在差异。因此，为了利用上述基因实现上述免疫疾病的研究和相关药物研发，亟需构建具有相关基因的人源化动物模型，尤其是小鼠模型。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提出构建一种crbn基因人源化动物模型，该动物模型构建方法结合ncf1基因多态性和lyz2基因靶向自发荧光标记的巨噬细胞示踪方法，通过膜蛋白cd68编码基因的启动子位置转录cre标记小鼠与stat1-floxp小鼠交配后建立条件性基因敲除cko小鼠，建立一种多对照，应用范围广的小鼠模型，有助于免疫疾病研究和药物研发。

2、采用的技术方案如下：

3、一种crbn基因人源化动物模型的构建方法，具体步骤如下：

4、步骤sa：所述构建方法中采用c57bl/6j品系小鼠，将c57bl/6j简称b6，所有小鼠均在b6后标识基因型，并以基因型后上角标中标识的“+”表示野生型；具体采用b6.faslpr/lpr品系、b6.ncf1m1j/m1j品系、b6.crbntm1.1ble品系、b6.stat1fl/fl品系、b6.cd68cre/cre品系、b6.lyz2akaluc品系小鼠；

5、步骤sb：使用b6.faslpr/lpr品系、b6.ncf1m1j/m1j品系、b6.lyz2akaluc品系三种小鼠两两杂交建立繁殖笼1、2、3；

6、步骤sc：使用所述繁殖笼1、2、3中子代双基因杂合小鼠自交建立繁殖笼4、5、6，对所述繁殖笼4、5、6中子代小鼠进行基因鉴定；

7、步骤sd：使用所述繁殖笼4、5中两种子代双基因纯合小鼠杂交建立繁殖笼7；

8、步骤sd：使用所述繁殖笼7中子代b6.faslpr/lpr.ncf1m1j/+.lyz2akaluc/+小鼠与所述繁殖笼6中子代双基因纯合小鼠杂交建立繁殖笼8，对所述繁殖笼8中子代小鼠基因鉴定；

9、步骤sf：使用所述繁殖笼8中子代小鼠自交建立繁殖笼9，对所述繁殖笼9中小鼠进行基因鉴定；

10、步骤sg：使用所述繁殖笼9中子代三基因纯合小鼠与b6.stat1fl/fl品系小鼠杂交建立繁殖笼10；

11、步骤sh：使用所述繁殖笼10中子代四基因杂合小鼠与繁殖笼9中子代三基因纯合小鼠杂交建立繁殖笼11，对所述繁殖笼11子代进行基因鉴定；

12、步骤si：使用所述繁殖笼11中子代b6.faslpr/lpr.ncf1m1j/m1j.lyz2akaluc.stat1fl/+小鼠自交建立繁殖笼12，对所述繁殖笼12子代进行基因鉴定；

13、步骤sj：使用所述繁殖笼12中子代四基因纯合小鼠与b6.cd68cre/cre品系小鼠杂交建立繁殖笼13；

14、步骤sk：使用所述繁殖笼13中子代五基因杂合小鼠与所述繁殖笼12中四基因纯合小鼠杂交建立繁殖笼14，对所述繁殖笼14子代进行基因鉴定；

15、步骤sl：使用所述繁殖笼14中子代小鼠自交建立繁殖笼15，对所述繁殖笼15子代进行基因鉴定；

16、步骤sm：使用所述繁殖笼15中子代五基因纯合小鼠与b6.crbntm1.1ble品系小鼠杂交建立繁殖笼16，对所述繁殖笼16子代进行基因鉴定；

17、步骤sn：使用所述繁殖笼16中子代六基因杂合小鼠与所述繁殖笼16中子代五基因纯合小鼠杂交建立繁殖笼17，对所述繁殖笼17子代进行基因鉴定；

18、步骤so：所述繁殖笼17中子代小鼠自交建立繁殖笼18，对所述繁殖笼18子代进行基因鉴定。

19、进一步，对所述子代基因进行鉴定时，其中，ncf1、crbn基因使用焦磷酸测序鉴定，其他基因使用pcr测序鉴定。

20、基于crbn基因人源化动物模型构建方法所获的动物模型，包括：通过对所述步骤so中获得的所述繁殖笼18的子代进行基因鉴定，即可得到模型：b6.faslpr/lpr.ncf1m1j/m1j.lyz2akaluc.stat1cko.crbntm1.1ble。

21、基于crbn基因人源化动物模型构建方法所获的动物模型，还包括：在所述步骤sa-so中省略所述步骤sm-so，通过对所述步骤sl所获得的所述繁殖笼15的子代进行基因鉴定，即可得到模型：b6.faslpr/lpr.ncf1m1j/m1j.lyz2akaluc.stat1cko。

22、基于crbn基因人源化动物模型构建方法所获的动物模型，还包括：在所述步骤sa-so中省略所述步骤sg-sl，在所述步骤sm中直接使用步骤sf获得的所述繁殖笼9中子代三基因纯合小鼠与b6.crbntm1.1ble小鼠杂交建立繁殖笼16，进而在最后通过对所述步骤so获得的所述繁殖笼18的子代进行基因鉴定，即可得到模型：b6.faslpr/lpr.ncf1m1j/m1j.lyz2akaluc.crbntm1.1ble。

23、基于crbn基因人源化动物模型构建方法所获的动物模型，还包括：在所述步骤sa-so中省略所述步骤sd-sf，在步骤sg中直接使用所述繁殖笼5中子代与b6.stat1fl/fl小鼠杂交建立繁殖笼10，进而在最后通过对所述步骤so获得的所述繁殖笼18的子代进行基因鉴定，即可得到模型：b6.faslpr/lpr.lyz2akaluc.stat1cko.crbntm1.1ble。

24、进一步，每种动物模型均实际杂交十代以上。

25、一种crbn基因人源化动物模型构建方法所获的动物模型在免疫疾病研究及治疗免疫疾病的药物研发的应用。

26、一种实施crbn基因人源化动物模型构建方法的构建系统。

27、本发明与现有技术相比所具有的有益效果：

28、1、本发明采用b6.lyz2akaluc品系小鼠与不同基因型小鼠杂交结合，使其表现自发荧光，实现不同背景下巨噬细胞荧光示踪；

29、2、本发明将ncf1基因多态性背景下巨噬细胞荧光示踪小鼠与b6.crbntm1.1ble品系小鼠杂交结合，构建一种crbn基因人源化的ncf1多态性自发荧光小鼠模型，可应用于多种免疫疾病研究；

30、3、本发明通过cd68基因启动子位置转录cre标记小鼠与stat1-floxp小鼠交配建立stat1条件性基因敲除小鼠，有利于免疫炎症的研究和相关药物研发。