一种建立斑马鱼血虚证模型的方法及其在筛选补血药物中的应用与流程

本发明涉及药物评价方法领域，尤其涉及一种建立斑马鱼血虚证模型的方法及其在筛选补血药物中的应用。

背景技术：

1、中医血虚证是指血液亏虚不能濡养脏腑、经络、形体器官，以面、脸、唇、舌色淡白，毛发不泽、头昏、脉细、乏力等为特征的综合性证候。依据中医血液化生的生理过程，血虚证的病因可以分为两大类，即血液损耗过度和血液生成不足。现代医学认为，血液中成分主要由血浆和血细胞组成。其中血浆中的主要成分是水，还含有多种凝血因子和蛋白，其主要发挥的功能主要是维持血压和血浆胶体渗透压。而血细胞是血液中主要的有形成分。血细胞中包含有三种细胞：即白细胞、红细胞和血小板。白细胞在人体中主要发挥免疫功能，根据白细胞胞质内有无特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞。前者常简称粒细胞，根据其特殊颗粒的染色性，又可分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞三种，其中中性粒细胞在人类所有白细胞的40-80％，为人类最丰富的粒细胞类型。红细胞内含有血红蛋白，主要发挥运输氧和营养物质，同时将二氧化碳运输到肺排出体外。血小板主要发挥止血的作血。基于上述理论基础，中医血虚证主要指的是血液中有形物质的减少，即血细胞的减少。因此，可以通过机体血液中红细胞、白细胞和血小板功能、数量变化情况来表征血虚证。

2、动物模型作为研究人类疾病病因、发病机制、治疗方法的一种重要工具，其在血虚证模型中有广泛的应用。在现有的方法中小鼠经常作为血虚证的模式生物，如发明专利“一种血虚小鼠的模型构建方法及评价方法”(公开号为cn110583573a)，但是以小鼠作为模式生物会存在试验周期长、实验成本高等问题，不适合未知药物药效评价的大量筛选。

技术实现思路

1、本发明为了克服现有技术下筛选药物的血虚证模型试验周期长、实验成本高的问题，提供一种建立斑马鱼血虚证模型的方法，该方法中斑马鱼血虚证模型构建高效、稳定且成本低，可实现简便、快速、高效和高通量实现对补血药物的补血性的定性或/和定量评价。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种建立斑马鱼血虚证模型的方法，包括如下步骤：

4、s1、使用环磷酰胺诱导斑马鱼建立血虚模型；

5、s2、使用环磷酰胺诱导tg(coro1a:dsred)斑马鱼建立中性粒细胞、巨噬细胞抑制模型。

6、本发明应用环磷酰胺-水合物诱导斑马鱼胚胎、幼鱼产生血虚证(即红细胞、骨髓细胞、中性粒细胞、巨噬细胞)等表型。环磷酰胺-水合物(cyclophosphamide hydrate，cyp)是一种烷化药，可以与dna、蛋白质的氨基、巯基、羧基发生烷化作用，从而对骨髓造血机能产生抑制作用。cyp也是一种免疫抑制药，可以使外周血白细胞减少及骨髓有核细胞数减少。cyp也是一种细胞周期抑制药，对骨髓细胞抑制作用尤为明显，可以使造血干/组细胞有g1期进入s期延迟。因此，cyp可以作为经典的骨髓抑制造模剂。

7、作为优选，所述s1中水溶给予48hpf斑马鱼1.25-3000μg/ml的环磷酰胺培养至72-120hpf建立血虚模型。

8、作为优选，所述s1中水溶给予48hpf斑马鱼800-3000μg/ml的环磷酰胺培养至72hpf建立急性血虚模型。

9、作为优选，所述s1中水溶给予48hpf斑马鱼32-160μg/ml的环磷酰胺培养至120hpf建立慢性血虚模型。

10、作为优选，所述s1中水溶给予120hpf tg(coro1a:dsred)斑马鱼1.25-3000μg/ml的环磷酰胺培养至144-192hpf建立中性粒细胞、巨噬细胞抑制模型。

11、作为优选，所述s1中水溶给予120hpf tg(coro1a:dsred)斑马鱼800-3000μg/ml的环磷酰胺培养至144hpf建立急性中性粒细胞、巨噬细胞抑制模型。

12、作为优选，所述s1中水溶给予120hpf tg(coro1a:dsred)斑马鱼32-160μg/ml的环磷酰胺培养至192hpf建立慢性中性粒细胞、巨噬细胞抑制模型。

13、第二方面，本发明提供了上述方法的在筛选补血药物中的应用，包括如下步骤：

14、a、将斑马鱼分为空白组、模型组及待筛药物组，模型组及待筛药物组使用上述方法建立血虚模型，待筛药物组在建模后给予待筛药物，检测分析各组斑马鱼的红细胞抑制情况；

15、b、将tg(coro1a:dsred)斑马鱼分为空白组、模型组及待筛药物组，模型组及待筛药物组使用上述方法建立中性粒细胞、巨噬细胞抑制模型，待筛药物组在建模后给予待筛药物，检测分析各组斑马鱼的中性粒细胞、巨噬细胞抑制情况。

16、比较模型组和待筛药物组红细胞抑制情况和中性粒细胞、巨噬细胞抑制情况可以评价待筛药物的补血效果。筛选时，当待筛药物为单体化合物时浓度可为200μg/ml；中药提取物浓度可为1mg/ml；化学合成混合物可为1mg/ml。

17、作为优选，所述红细胞抑制情况的检测方法和中性粒细胞、巨噬细胞抑制情况的检测方法中将斑马鱼整体倾斜45°后进行拍照。

18、作为优选，所述a和b中还包括设置细胞色素抑制剂组，细胞色素抑制剂组、模型组及待筛药物组均给予65-80μm细胞色素抑制剂。

19、细胞色素抑制剂可抑制斑马鱼体表的细胞色素产生，减少背景干扰。

20、作为优选，所述细胞色素抑制剂为1-苯基-2-硫脲。

21、作为优选，所述红细胞抑制情况的检测方法为：将斑马鱼清洗后用邻联茴香胺染色液染色10-20min，再清洗斑马鱼，用显微镜观察鱼肚并拍照，使用图像处理软件分析照片中的染色面积；

22、中性粒细胞、巨噬细胞抑制情况的检测方法为：将tg(coro1a:dsred)斑马鱼清洗后，用荧光显微镜观察tg(coro1a:dsred)斑马鱼全身并拍照，使用图像处理软件分析照片中的荧光强度、荧光面积。

23、作为优选，所述中性粒细胞、巨噬细胞抑制情况的检测方法还包括对照片进行均一化宏处理图像分析，通过如下代码将照片转为32bit格式：

24、run("32-bit")；

25、//settool("rectangle")；

26、makerectangle(12,6,1588,1140)；

27、run("duplicate...","")；

28、setautothreshold("default dark")；

29、//run("threshold...")；

30、setthreshold(64.9229,183.3333)；

31、setoption("blackbackground",true)；

32、run("convert to mask")；

33、run("set measurements...","area mean min fit feret's integrated area_fraction limit redirect＝none decimal＝3")；

34、run("measure")；

35、手动选择生成的32bit图像中动脉血液中的荧光后，利用如下代码做均一化荧光面积计算宏处理：

36、setautothreshold("default dark")；

37、//run("threshold...")；

38、run("measure")；。

39、因此，本发明具有如下有益效果：

40、(1)建立了血虚证斑马鱼模型，可视化性强，由于斑马鱼胚胎、幼鱼初期为透明的，可以通过染色或荧光观察斑马鱼个体中红细胞、骨髓细胞、中性粒细胞、巨噬细胞变化情况；

41、(2)实验验周期短，成本低；每对斑马鱼产生200-300个受精卵，相较于小鼠而言，成本低廉。斑马鱼胚胎初期造血时间较早，约受精后24小时建立血液循环，试验时间成本大为降低。