一种神经母细胞瘤肝脏原位移植瘤动物模型的建立方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种神经母细胞瘤肝脏原位移植瘤动物模型的建立方法。

背景技术：

1、神经母细胞瘤(neuroblastoma，nb)是儿童最常见的实体恶性肿瘤，居我国儿童肿瘤发病率第四位，占儿童肿瘤死亡人数的10-20％。nb动物模型可以表征nb发展特征，nb小鼠模型已被广泛应用于研究nb的发病机制与新药物开发，但在不同研究中，选用不同的实验动物、移植物、移植方式均存在较大差异。研究表明，相对于其他移植瘤模型，原位移植瘤模型不仅能维持原有瘤组织的结构，而且还保持了人体瘤的绝大部分生物学特性，特别是转移特性，因此在肿瘤模型构建中被广泛应用。

2、相关研究表明，nb最显著的特点是多部位发生，临床上最典型的发生部位是肾上腺，也有临床报道4s期患者肝脏出现弥漫性肿物而影像学未见肾上腺相关肿瘤，其原发部位不明。目前，有关神经母细胞瘤原位模型的构建大都在肾上腺，极少研究在nb的其他多发部位构建出能模拟人临床肿瘤生长过程动物模型，迫切需要研究者构建出更多理想的、可高度复制的原位模型用来支持nb的科学研究。然而由于小鼠肾上腺体积小、易被脾脏等其他脏器遮挡，不仅导致注射量受到限制、不易于手术操作，而且肾上腺原位移植小鼠通常生存周期较短，不利于后期肿瘤转移研究。

3、因此，本发明创新性地建立一种nb肝脏原位移植动物模型，探讨其相对于传统肾上腺原位移植模型的优势，为进一步研究nb发生、发展及治疗提供了技术支持，同时，也为研究者提供更多的模型选择。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种神经母细胞瘤肝脏原位移植瘤动物模型的建立方法，其相对于传统肾上腺手术操作难度低，且具有细胞接种量小、成瘤率高、生存时间长，手术操作简单等特点，对提高建立神经母细胞瘤模型准确度，为后期研究者提供了更多模型选择具有深远意义。

2、本发明还提出一种神经母细胞瘤肝脏原位移植瘤动物模型的建立方法得到的动物模型在药物筛选或药物毒性分析中应用。

3、本发明的第一方面，提供一种神经母细胞瘤肝脏原位移植瘤动物模型的建立方法，具体包括以下步骤：

4、s1、筛选免疫缺陷小鼠；

5、s2、将神经母细胞瘤细胞系接种于所述免疫缺陷小鼠的肝脏，饲养7～45天即可。

6、根据本发明实施例的建立方法，至少具有如下有益效果：

7、(1)本发明的神经母细胞瘤肝脏原位移植瘤动物模型的建立方法相对于传统肾上腺原位移植模型构建的手术操作难度低，且具有细胞接种量小、成瘤率高、生存时间长，手术操作简单等特点，有助于提高建立神经母细胞瘤模型准确度。

8、(2)对本发明的构建的神经母细胞瘤肝脏原位移植瘤动物模型进行术后观察，显示本发明在肝脏移植肿瘤后在21d后成瘤率均为100％，与肾上腺移植肿瘤的成瘤率效果相当，且存活期高于肾上腺原位移植模型组，能够达到40天，并且在35d后出现了肝脏、脾、肠和肾等多个器官的明显转移，与某些4s患者出现的影像学肿瘤特征高度符合，为进一步研究nb的治疗奠定了良好的科研基础。

9、在本发明的一些实施方式中，所述肝脏优选为肝左叶。

10、肝左叶面积大，大部分不被肋骨所覆盖，便于观察注射，并且肝左叶血流旺盛，能更好的为肿瘤提供生长环境。此外，传统肾上腺原发肿瘤后期大多转移至肝脏，选择肝脏移植能模拟出神经母细胞瘤发病情况。

11、在本发明的一些实施方式中，所述免疫缺陷小鼠包括重度免疫缺陷小鼠。

12、在本发明的一些实施方式中，所述重度免疫缺陷小鼠为在nod/shiltjgpt小鼠模型基础上敲除prkdc和il2rg基因的免疫缺陷小鼠。

13、在本发明的一些实施方式中，所述重度免疫缺陷小鼠为ncg免疫缺陷小鼠。

14、ncg免疫缺陷小鼠由于缺少t细胞、b细胞和nk细胞活性，先天免疫水平低，对于神经母细胞瘤细胞系移植物更容易接受，有助于提高成瘤率。

15、在本发明的一些实施方式中，所述免疫缺陷小鼠为雌性。

16、在本发明的一些实施方式中，所述免疫缺陷小鼠为5～8周龄。

17、在本发明的一些实施方式中，所述免疫缺陷小鼠的体重为14～24g。

18、在本发明的一些实施方式中，所述神经母细胞瘤细胞系包括sk-n-sh细胞系、sh-sy5y细胞系、la-n-1细胞系、be2-c细胞系、nb69细胞系中的至少一种。

19、在本发明的一些实施方式中，所述神经母细胞瘤细胞系包括sk-n-sh细胞系。

20、sk-n-sh细胞系是一种具有多能性的人类神经母细胞瘤细胞系，可分化为神经样细胞和髓样细胞。它通常表现出成纤维样形态并能够形成以成纤维样和多克隆球形形式的肿瘤样结构，将其接种于肝脏构建的神经母细胞瘤原位移植瘤模型具有优异的成瘤能力。

21、在本发明的一些实施方式中，所述神经母细胞瘤细胞系包括sk-n-sh-luc-puro细胞系。

22、sk-n-sh-luc-puro细胞系是一种具有携带luciferase荧光标记基因和耐受puromycin特征的人神经母细胞瘤细胞系。

23、在本发明的一些实施方式中，所述神经母细胞瘤细胞系的获取方法包括：将所述神经母细胞瘤细胞接种于rpmi 1640培养基中培养至对数生长期，然后用胰蛋白酶消化，再用缓冲液重悬即得。

24、在本发明的一些实施方式中，所述rpmi 1640培养基为含有8～12％胎牛血清、50～150u/ml青链霉素的rpmi 1640培养液。

25、在本发明的一些实施方式中，所述胰蛋白酶的浓度为0.2％～0.3％(v/v)。

26、在本发明的一些实施方式中，所述胰蛋白酶的浓度为0.25％(v/v)。

27、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液包含磷酸缓冲液和基质胶。

28、在本发明的一些实施方式中，所述磷酸缓冲液和基质胶的体积比为1：0.8～1.2。

29、在本发明的一些实施方式中，所述神经母细胞瘤细胞系的细胞密度为0.1×105～2×105cells/μl。

30、在本发明的一些实施方式中，所述神经母细胞瘤细胞系的接种量为3～10μl/只。

31、本发明的第二方面，提供第一方面所述的建立方法得到的动物模型在药物筛选或药物毒性分析中应用。

32、根据本发明实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明的神经母细胞瘤原位移植瘤模型具有细胞接种量小、成瘤率高、生存时间长(45天)，手术操作简单等特点，将其构建得到的动物模型应用于药物筛选或药物毒性分析中能够有效降低成本。此外，由于本发明的神经母细胞瘤原位移植瘤模型是将人体的肿瘤细胞株或组织移植到实验动物的相应部位，其生长微环境与原发肿瘤更接近，对应原位瘤表型也更接近人类表型，因此有利于提高药物筛选的准确性。

33、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。