本发明涉及颅骨保存，具体涉及一种低温颅骨保存液及其制备方法和颅骨低温保存方法。
背景技术：
1、神经外科去骨瓣减压术是解除因脑外伤、脑出血、脑肿瘤以及大面积脑梗塞等所致颅内高压的有效手段。但是，手术中去除骨瓣所造成的颅骨缺损，使患者失去正常颅骨的屏障作用，并严重影响外观，对患者将来回归社会的生理和心理均造成很大影响，因此，一般在手术后3-6月，待颅内高压完全解除，患者基本康复后，大多数患者需要接受颅骨缺损的修补手术。
2、然而，自体颅骨的储存方法仍是困扰业界的巨大难题。现有技术中，自体颅骨的储存方法主要包括两种：体内储存和体外储存。所谓体内储存，是指将手术中取出的颅骨瓣直接植入患者的大腿内侧或腹部皮下备用，待患者3-6月后需行颅骨修补时，再将颅骨瓣取出。然而，由于“自体骨吸收现象”，颅骨瓣植入后，随时间的延长而逐渐缩小，以至于无法修补原来的缺损。同时，这种储存方式必须经历两次创伤，不仅增加新的疤痕，还增加了感染风险。因此，越来越多的研究者将目标放在自体颅骨瓣的体外储存方法上。
3、对自体颅骨实施低温保存时，一般是采用冷冻法，这对于细胞悬浮液不会造成问题，但对于大体积的自体颅骨组织，胞外冰晶的形成所造成的伤害将是致命的。玻璃化法可完全避免细胞内外冰晶的形成，但目前的实施方法要求很高的冷却速率，这对大体积生物组织样品来说也是很难达到的。
4、中国专利文献cn103623464a公开了一种自体颅骨瓣回植技术的制备方法，包括如下步骤：(1)去污工艺：采用普通洗涤剂将骨表面的油污等杂质清洗干净，然后再用蒸馏水冲洗干净，晾干后获得完全的自体颅骨基质；(2)病毒灭活工艺：在室温条件下，用10g/l过氧乙酸和体积分数24％乙醇组成的过氧乙酸-乙醇混合液，微波震荡浸泡自体颅骨基质4-6小时；(3)去蛋白工艺：在室温条件下，将自体颅骨基质放入浓度为10-20％的双氧水中微波震荡浸泡48-72小时，然后再用纯化水冲洗干净；(4)脱脂工艺：用95％的酒精、乙醚，及洗洁净浸泡脱脂和纯化水冲洗，把自体颅骨基质放入离心机脱水后，在常温下自然干燥；(5)脱细胞工艺：在2-5℃条件下，将上述去脂步骤后获得的骨头基质放入浓度为0.5-1.0％的十二烷基硫酸钠和浓度为0.8-1.2％的蛋白酶抑制剂pmsf的混合液中采用搅拌震荡的方式浸泡24-48小时，然后再用纯化水循环冲洗24-48小时；在2-5℃条件下，再将自体颅骨基质放入浓度为0.1-0.4％的胰蛋白酶中浸泡12-24小时，然后再用纯化水循环冲洗20-28小时，获得脱细胞基骨；(6)冻干工艺：将经脱细胞工艺后制备好的自体颅骨，放入冷冻干燥机冻干；(7)包装、灭菌工艺：在洁净间内封装，采用环氧乙烷或co-60进行灭菌。该方法为达到灭菌目的，需采用洗涤剂去污，过氧乙酸与乙醇的混合液病毒灭活，双氧水去蛋白，乙酸和乙醚脱脂以及十二烷基硫酸钠、蛋白酶抑制剂脱细胞等工艺步骤，不但工序复杂，无法实现规模化处理，而且，大量化学制剂的应用，使颅骨瓣中的活性物质大量丧失，甚至使颅骨瓣完全丧失活性而成为死骨。更令人困惑的是，如何排尽那些残留于颅骨瓣中的化学物质，以及这些化学物质是否对身体产生长远危害，目前尚无确凿的理论依据和最终定论。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提出一种低温颅骨保存液及其制备方法和颅骨低温保存方法，该低温颅骨保存液能够起到很好的冰再结晶抑制作用，能降低细胞外液和细胞内容物的冰点，推迟冰晶形成速度，使得整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化，保护颅骨及颅骨组织细胞不被破坏，同时能提供能量、营养，有骨诱导活性，促进回植后骨骼、骨组织的生长和修复，颅骨低温保存方法也能够很好应用于各类手术中，成功率高，安全性好。
2、本发明的技术方案是这样实现的：
3、本发明提供一种低温颅骨保存液的制备方法，将海藻糖与马来酸酐反应后，与赖氨酸反应，继续与长链卤代烷反应，在引发剂的作用下，制得聚疏水改性赖氨酸/海藻糖，与青霉素、海藻糖、甘油、复合氨基酸、果糖或半乳糖、微量元素、pbs缓冲液混合均匀，制得低温颅骨保存液。
4、作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
5、s1.双键羧基化海藻糖的制备：将海藻糖与马来酸酐在碱的存在下反应，制得双键羧基化海藻糖；
6、s2.赖氨酸-双键海藻糖的制备：将步骤s1制得的双键羧基化海藻糖经过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺活化后，与赖氨酸反应，制得赖氨酸-双键海藻糖；
7、s3.疏水改性赖氨酸-双键海藻糖的制备：将卤代烷和步骤s2制得的赖氨酸-双键海藻糖在碱的存在下反应，制得疏水改性赖氨酸-双键海藻糖；
8、s4.聚疏水改性赖氨酸/海藻糖的制备：将步骤s3制得的疏水改性赖氨酸-双键海藻糖在引发剂的作用下反应，制得聚疏水改性赖氨酸/海藻糖；
9、s5.低温颅骨保存液的制备：将步骤s4制得的聚疏水改性赖氨酸/海藻糖、青霉素、海藻糖、甘油、复合氨基酸、果糖或半乳糖、微量元素、pbs缓冲液混合均匀，制得低温颅骨保存液。
10、作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述海藻糖、马来酸酐、碱的摩尔比为2-4:1:3-5，所述反应的温度为60-70℃，时间为5-7h；所述碱选自三乙胺、koh、naoh中的至少一种。
11、作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述双键羧基化海藻糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺、赖氨酸的摩尔比为1:2-2.2:2-2.2:1.2-1.4，所述反应的温度为室温，时间为12-15h。
12、作为本发明的进一步改进，步骤s3中所述卤代烷、赖氨酸-双键海藻糖、碱的摩尔比为0.9-1:1.1-1.2:3-5，所述碱选自三乙胺、koh、naoh中的至少一种，所述卤代烷选自1-氯十二烷、1-氯十四烷、1-氯十六烷、1-氯十八烷、1-溴十二烷、1-溴十四烷、1-溴十六烷、1-溴十八烷中的至少一种，所述反应的温度为55-65℃，时间为3-5h。
13、作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述引发剂选自过硫酸钠、过硫酸钾、过硫酸铵中的至少一种，所述引发剂的添加量为体系总质量的1-2wt％，所述反应的温度为50-55℃，时间为2-4h，所述疏水改性赖氨酸-双键海藻糖的浓度为22-25wt％。
14、作为本发明的进一步改进，步骤s5中所述聚疏水改性赖氨酸/海藻糖、青霉素、海藻糖、甘油、复合氨基酸、果糖或半乳糖、微量元素、pbs缓冲液的质量比为7-10:0.5-1:8-12:3-5:1-2：2-4:0.5-1:120-150，所述pbs缓冲液的ph值为7.3-7.5，所述微量元素包括氯化钾、氯化钠、氯化锌、氯化钙，质量比为5-7:7-10:1-2:1-2，所述复合氨基酸选自丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸中的至少两种。
15、本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的低温颅骨保存液。
16、本发明进一步保护一种上述低温颅骨保存液在低温保存颅骨、活性骨、骨组织中的应用。
17、本发明进一步保护一种颅骨低温保存方法，包括以下步骤：
18、(1)收集颅骨组织：
19、在无菌条件下，将术中取出准备植入的颅骨后，取少量碎骨进行病理切片，从骨头上去除多余的软组织，用碘伏消毒液浸泡，在用75％乙醇脱碘，用庆大霉素盐水反复冲洗干净，加入上述低温颅骨保存液中，封存；
20、(2)颅骨的处理：
21、在无菌条件下，将取出的颅骨放入盛有缓冲液的培养皿中，去除骨膜及周围结缔组织，用2.5mm克氏针每间隔1cm钻孔，pbs缓冲液清洗，将洗好的颅盖骨片置于培养皿中，加入培养液，将培养瓶置于37℃、5％co2、饱和湿度的co2培养箱中培养24h，取出，加入上述低温颅骨保存液中，封存；
22、(3)降温保存：
23、将步骤(1)中的颅骨组织和步骤(2)中的颅盖骨片在室温下放置10-15min，然后置于3-5℃平衡15-20min，以0.8-1.2℃/min降温至-20至-25℃，保存30-50min，再以1-1.5℃/min降温至-78至-85℃保存；
24、(4)无菌检测：对保存的颅骨组织和颅盖骨片取样进行无菌检测；
25、(5)复温及低温颅骨保存液的洗脱：
26、无菌条件下，将冻存的颅骨组织和颅盖骨片置于36-38℃的水浴中至低温颅骨保存液融化，将颅骨组织和颅盖骨片取出，用基础保存液采用连续洗脱法进行洗脱20-40min，取出颅骨组织和颅盖骨片加入基础保存液保存；
27、(6)富血小板血浆共培养：
28、将采集的待回植颅骨患者全血在室温下于4-6h内以转速为1000-1500r/min离心3-7min，使红细胞、白细胞下沉，分离出上层血浆，为富血小板血浆，获得全血中70％以上血小板，在基础保存液加入10wt％富血小板血浆与颅骨共培养置于37℃、5％co2、饱和湿度的co2培养箱中培养24h后，无菌封装，4℃保存，于24h内进行回植手术，回植时将颅骨和颅骨组织取出，生理盐水冲洗后直接回植。
29、所述基础保存液为青霉素、复合氨基酸、果糖或半乳糖、微量元素、pbs缓冲液按照质量比为质量比为0.5-1:1-2:2-4:0.5-1:120-150的混合液；所述pbs缓冲液的ph值为7.3-7.5，所述微量元素包括氯化钾、氯化钠、氯化锌、氯化钙，质量比为5-7:7-10:1-2:1-2，所述复合氨基酸选自丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸中的至少两种。
30、优选地，所述基础保存液为青霉素、复合氨基酸、果糖或半乳糖、微量元素、pbs缓冲液按照质量比为质量比为0.7:1.5:3:0.7:135的混合液；所述pbs缓冲液的ph值为7.4，所述微量元素包括氯化钾、氯化钠、氯化锌、氯化钙，质量比为6:8.7:1.5:1.2；所述复合氨基酸为谷氨酸和脯氨酸的混合物，质量比为8:3。
31、本发明具有如下有益效果：
32、本发明低温颅骨保存液中，渗透类(甘油)和半渗透抗冻剂(氨基酸)渗入到细胞内后，增加整个细胞的黏度和细胞内溶质浓度，干扰水分子的空间排列方向，使冰晶生长的驱动力减弱，晶体生长速率降低，能降低细胞外液和细胞内容物的冰点，推迟冰晶形成速度，使得整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化，从而避免“胞内冰损伤”、“溶质性损伤”和“细胞骨架系统损伤”等。
33、另外，本发明低温颅骨保存液中，海藻糖在细胞表面形成独特的保护膜,有效地保护生物分子的结构不被破坏,从而维持生命体的生命过程和生物特征。海藻糖与脂质膜相互作用，在冻融过程中可以在细胞膜表面产生玻璃化层，减少冰晶对细胞膜的损伤，但是海藻糖在细胞膜两侧时，才能充分发挥保护作用，将海藻糖官能化后聚合得到的海藻糖疏水聚合物能够通过扰动细胞膜磷脂层进入细胞膜，从而使得在细胞膜两侧均含有一定浓度的海藻糖，从而发挥出很好的保护作用，能够紧密包住邻近的水分子，从而形成与冰相似的化合物玻璃体，在一定程度上维持生物大分子的空间结构，保护生物分子结构和功能。
34、同时，本发明制备的聚疏水改性赖氨酸/海藻糖带有赖氨酸结构，能够起到很好的冰再结晶抑制作用，同时，促进聚疏水改性赖氨酸/海藻糖对细胞膜的渗透作用，还能起到很好的抗细胞衰老和促进新生骨生长的作用，有助于骨骼、骨组织的生长和修复，有助于钙的吸收和骨蛋白的形成。
35、另外，果糖或半乳糖提供能量，氨基酸和微量元素可以为骨组织提供营养。青霉素是一种杀菌剂，还具有消除抗原性，保留骨诱导活性的作用。
36、本发明制备了一种低温颅骨保存液，能够起到很好的冰再结晶抑制作用，能降低细胞外液和细胞内容物的冰点，推迟冰晶形成速度，使得整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化，保护颅骨及颅骨组织细胞不被破坏，同时能提供能量、营养，有骨诱导活性，促进回植后骨骼、骨组织的生长和修复，颅骨低温保存方法也能够很好应用于各类手术中，成功率高，安全性好。