一种巨花多穗蓼的组织培养方法与流程

本发明涉及植物组织培养，尤其涉及一种巨花多穗蓼的组织培养方法。

背景技术：

1、巨花多穗蓼（ persicaria polymorpha），属于蓼科蓼属园艺变种，为多年生灌木型宿根草本。巨花多穗蓼适应性广泛，在全日照或夏季稍有遮阴的环境下都生长良好，亦可忍受土壤稍湿润，在冬季耐寒可达零下25-35摄氏度，春季发芽生长，夏季开花，花期可从6月持续至9月，花序大而洁白。故巨花多穗蓼植株因其较高的观赏价值和优异的适应能力，适用于花境布置、私家花园庭院栽植，市场前景良好。

2、与其他蓼科植物不同，巨花多穗蓼无法通过种子自播，只能依靠无性分株繁殖。分株繁殖效率低，种苗整齐度差，不利于产业化推广。因此，巨花多穗蓼繁殖方式限制了巨花多穗蓼的应用推广。目前针对巨花多穗蓼的组织培养技术的研究很少。有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种巨花多穗蓼的组织培养方法以及用于巨花多穗蓼组织培养的培养基。

2、具体地，本发明提供以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种巨花多穗蓼的组织培养方法，所述方法包括：以巨花多穗蓼带芽点茎段作为外植体，依次进行诱导茎段芽点萌发培养、腋芽增殖培养和诱导不定芽生根培养；诱导茎段芽点萌发培养的培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba 0.1-0.5mg/l，naa 0.1-0.5mg/l；腋芽增殖培养的培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba 2.0-3.0mg/l。

4、本发明的巨花多穗蓼组织培养方法中，以生长健壮且无病虫害的巨花多穗蓼母株的带芽点茎段作为外植体进行组织培养。

5、优选地，上述方法以萌芽阶段的带芽点茎段作为外植体。

6、本发明发现，选择上述萌芽阶段的带芽点茎段作为外植体进行组织培养，更有利于提高巨花多穗蓼的诱导成功率。萌芽阶段的小芽能够在离体培养条件下具有更高的分裂活性，配合适宜的离体培养基能够在离体培养条件下旺盛分裂，在一定程度上可提高组织培养的诱导率和成功率，同时能够有效缩短组织培养过程中的诱导周期，并提高增殖系数。另外与萌芽后完全展叶的芽相比，选择生长期较短的萌芽阶段的带芽点茎段作为外植体，因其受到外界的干扰较小，可有效降低外植体的污染率。且完全展叶的芽较处于萌芽阶段的茎段芽点，细胞代谢活动减弱，诱导成功率和增殖率下降。

7、在本发明提供的较为具体的实施方式中，巨花多穗蓼组织培养方法的整体流程如下：对取自生长健壮且无病虫害的巨花多穗蓼母株上的带芽点茎段消毒处理后，利用诱导茎段芽点萌发的培养基对上述带芽点茎段进行诱导，在适宜的培养环境下，诱导茎段腋芽萌发。将诱导出的腋芽从茎段上剥离，再利用诱导腋芽增殖的培养基对腋芽进行诱导，在适宜的培养环境下，腋芽增殖形成丛生芽。将丛生芽分离成单株，在诱导不定芽生根的培养基上对单株进行生根诱导，形成生根苗。

8、上述组织培养方法中，诱导茎段芽点萌发培养使用的培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba（6-苄氨基腺嘌呤） 0.2-0.5mg/l，naa（萘乙酸）0.1-0.2mg/l。腋芽增殖培养的培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba 2.0-3.0mg/l。

9、本发明发现，分别采用上述特定的培养基作为诱导茎段芽点萌发培养阶段和腋芽增殖培养阶段的培养基，能够使得两个培养阶段很好地衔接和配合作用，有效提高腋芽的分化情况，同时提高腋芽的增殖效率。

10、其中，诱导茎段芽点萌发的培养基中，使用6-ba和naa作为诱导激素。上述两种激素在特定的浓度下配合作用，能够更好地促进细胞的增殖和扩大，诱导外植体脱分化和腋芽萌发。与单独采用naa的诱导培养基相比，上述诱导茎段芽点萌发的培养基能够有效提高腋芽的分化情况，从而提高巨花多穗蓼的繁殖效率。

11、上述诱导腋芽增殖的培养基中，单独添加6-ba作为植物激素，与同时添加6-ba和naa配合作用比较：单独添加6-ba作为植物激素增殖效果较好，且不影响增殖过程中的丛生芽长势，故选择在诱导腋芽增殖的培养基中只添加6-ba一种激素。

12、进一步优选地，诱导茎段芽点萌发培养使用的培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba（6-苄氨基腺嘌呤）0.2-0.5mg/l，naa（萘乙酸）0.1-0.2mg/l，蔗糖25-30g/l，琼脂4-4.5g/l；腋芽增殖培养使用的培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba 2.0-3.0mg/l，蔗糖25-30g/l，琼脂4-4.5g/l。

13、更优选地，诱导茎段芽点萌发培养使用的培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba（6-苄氨基腺嘌呤）0.5mg/l，naa（萘乙酸）0.1mg/l，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l；腋芽增殖培养使用的培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba 2.0mg/l，蔗糖30g/l，琼脂4.5g/l。

14、上述组织培养方法中，诱导不定芽生根培养使用的培养基优选以1/2 ms培养基为基本培养基并包含如下组分：活性炭0.3-0.5g/l，蔗糖25-30g/l，琼脂4-5g/l。

15、优选地，上述诱导不定芽生根的培养基中，不添加植物激素。

16、本发明发现，配合上述诱导茎段芽点萌发培养和腋芽增殖培养，在诱导不定芽生根阶段，不添加植物激素即能够获得100%的生根率。不定芽能够在生根培养基及自身合成的各类激素的共同作用下，促进生根形成小苗。在诱导不定芽生根的培养基中，还加入了活性炭。活性炭能够吸附不定芽的代谢产物和上一阶段的激素残留，利于植株的茁壮与生根。

17、进一步优选地，诱导不定芽生根培养使用的培养基以1/2 ms培养基为基本培养基并包含如下组分：活性炭0.5g/l，蔗糖25g/l，琼脂4.5g/l。

18、在本发明的一些实施方式中，诱导不定芽生根培养使用的培养基为在1/2ms培养基中按比例添加活性炭，蔗糖和琼脂得到。

19、在本发明中，上述诱导茎段芽点萌发培养、腋芽增殖培养或诱导不定芽生根培养使用的培养基的ph值优选为5.8-6.0。

20、在本发明中，以上所述的组织培养方法诱导茎段芽点萌发培养、腋芽增殖培养或诱导不定芽生根培养优选采用以下条件：培养温度为23-27℃，光照强度为1500-2300 lux，光照时长为8-10h/d。

21、在本发明中，以上所述的组织培养方法优选在诱导茎段芽点萌发培养前，对外植体进行消毒处理；

22、在本发明中，所述消毒处理优选包括如下步骤：先以水冲洗后，再依次进行0.05-0.15%新洁尔灭溶液处理、70-80%酒精消毒处理和0.05-0.15%氯化汞溶液处理。本发明所述消毒处理的方式优选为浸泡震荡。

23、采用新洁尔灭溶液和酒精浸泡震荡消毒后，可杀灭附着在材料表面的部分病原体，有效排除外植体表面可能附带的污染源的干扰；氯化汞能够杀死繁殖体、亲脂性病毒等，对外植体携带的病原体等具有很强的杀灭作用，进一步提高外植体消毒的成功率。本发明中，先用新洁尔灭溶液作为阳离子表面活性剂的杀菌作用，对稍木质化的茎段进行初步处理，再利用酒精较强的浸润作用，排除外植体表面的空气，利于氯化汞的渗入，从而提高氯化汞对外植体材料表面的浸透性，提高消毒剂的消毒效果。

24、优选地，所述新洁尔灭溶液处理的时间为20-30min；所述酒精消毒的时间为30-60s；所述氯化汞溶液处理的时间为10-15min。

25、更优选地，所述新洁尔灭溶液处理的时间为20min；所述酒精消毒的时间为30s；所述氯化汞溶液处理的时间为10min。

26、优选地，新洁尔灭溶液处理使用0.1%新洁尔灭溶液，酒精消毒使用75%酒精。氯化汞溶液处理使用0.1%氯化汞溶液。

27、优选地，在新洁尔灭溶液处理后、酒精消毒后和氯化汞溶液处理后均以无菌水进行清洗外植体。

28、在本发明的一些具体实施方式中，所述巨花多穗蓼的组织培养方法包括：外植体的获取和消毒、诱导茎段芽点萌发、腋芽增殖以及诱导不定芽生根。

29、第二方面，本发明提供用于巨花多穗蓼组织培养的培养基，所述培养基包括诱导茎段芽点萌发培养的培养基、腋芽增殖培养的培养基和诱导不定芽生根培养的培养基；

30、所述诱导茎段芽点萌发培养的培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba 0.1-0.5mg/l，naa 0.1-0.5mg/l，蔗糖 25-30g/l，琼脂4-5g/l；

31、所述腋芽增殖培养的培养基以ms培养基为基本培养基并包括如下组分：6-ba2.0-3.0mg/l，蔗糖25-30g/l，琼脂4-5g/l；

32、所述诱导不定芽生根培养的培养基以1/2 ms培养基为基本培养基并包含如下组分：活性炭0.3-0.5g/l，蔗糖25-30g/l，琼脂4-5g/l。

33、第三方面，本发明还提供以上所述的用于巨花多穗蓼组织培养的培养基在巨花多穗蓼组织培养中的应用。

34、优选地，所述应用为以巨花多穗蓼的带芽点茎段作为外植体进行组织培养。

35、有益效果：

36、本发明选择巨花多穗蓼母株的带芽点茎段作为外植体进行巨花多穗蓼的组织培养，并针对该外植体开发了适宜的诱导茎段芽点萌发、腋芽增殖以及诱导不定芽生根的培养培养基和培养方法。利用本发明的巨花多穗蓼组织培养方法，能够有效提高巨花多穗蓼腋芽的诱导成功率，缩短诱导周期，提高巨花多穗蓼的增殖系数和生根率，从而实现巨花多穗蓼的快速繁殖，促进巨花多穗蓼的应用。