制备鳗草体细胞胚的方法、扩繁鳗草的方法以及试剂盒与流程

本发明属于生物，具体涉及一种制备鳗草体细胞胚的方法及其在鳗草繁育中的应用，包括扩繁鳗草的方法以及在所述方法总使用的试剂盒。

背景技术：

1、鳗草(zostera marina l.)是大叶藻属(zostera)的多年生海草植物，在维护海草床生态系统中的作用很大，在我国北半球浅水海域具有广泛分布。

2、近一个世纪来，由于气候变暖、过度捕捞、围垦造田、台风、营养盐富集和水体浑浊度增加等原因，鳗草的野生种群数量急剧下降，已经严重威胁该植物的生存。目前，全球约30％的海草床已退化消失，消失速度还在增加。在我国山东半岛日照海域和乳山海域的鳗草海草床已经消失，而莱州湾芙蓉岛附近海域的鳗草海草床面积则退化至不足5hm2。因此，利用生物技术快速繁育鳗草，对于修复海草床生态系统、保护物种迫在眉睫。

3、鳗草的传统繁殖方式主要是有性繁殖和无性繁殖两种繁殖途径。无性繁殖就是通过海草地下茎克隆出新的个体，即由母株长出的一条地下横走茎，然后再发育成新植株。有性繁殖即种子繁殖方式，包括开花、传粉、受精和发育等四个过程。但由于草床水流、植物病害、种子捕食者如鱼类、无脊椎动物均会降低自然环境种的有效种子库大小。而且，在鳗草建苗的适宜季节到来之前，大部分新生的种子将消失，其中一半种子自发性死亡，另一半种子萌发，但仅有13％萌发后的种子能成长成幼苗。

4、利用组织培养技术繁殖鳗草，可以通过愈伤组织、分化或通过无菌苗殖培养等技术途径获得无菌苗。但是，由于鳗草属于藻类植物，生活在高盐海水环境的特殊性，以及自身种质基因的差异，在利用离体组织培养途径繁育时，存在细胞脱分化、分化以及植株再生的困难，导致分化率低、植株再生增殖系数低；而且传统组织培养存在操作环节多、过程繁琐、容易污染等问题，引起组织培养方式的生产效率低和成本相对较高，再一定程度上限制该技术在鳗草繁育中的应用。另外，目前的鳗草种子繁殖方式存在着季节性、场地占用面积大、种子萌发率低、天然种子数量少等突出问题。因此，采用效率更高、成本更低、劳动量更小的生物技术，进行鳗草种苗的快速繁殖与生产具有重要的实际意义。

5、本发明根据鳗草植株细胞特点，通过分离胚性细胞、增殖培养及体细胞胚诱导和人工种子制备，建立了一种高效、成本低的鳗草繁育技术工艺，单位体积内体细胞胚数量提高2倍、人工种子萌发率达到70％以上，比传统的组织培养技术制苗的成本降低60％以上。

6、因此，综合考虑，根据鳗草的物种特性及生长习性，利用生物技术无性繁殖鳗草植株，通过适合的方式在浅海区域大面积种植，对于海草生态系统修复具有重要价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种制备鳗草体细胞胚的方法及其在鳗草快繁中的应用。

2、本发明提供了一种制备鳗草体细胞胚的方法(方法a)，包括如下步骤：

3、(i)取鳗草无菌苗的根尖，切成0.5cm根段，接种到培养基甲上，20±2℃黑暗培养20～25天，直至观察到从根尖切口处生长出浅黄色胚性愈伤组织；

4、(ii)取步骤(i)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，20±2℃黑暗培养20～25天；

5、(iii)取步骤(ii)得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，20±2℃黑暗培养20～25天；

6、(iv)将1～2g步骤(iii)得到的胚性愈伤组织加至50～60ml培养基乙中，20±2℃黑暗条件下设置转速80～100rpm振荡培养20～25天；

7、(v)完成步骤(iv)后，将1体积份培养体系与2体积份所述培养基乙混合，20±2℃黑暗条件下设置转速80～100rpm振荡培养20～25天；

8、(vi)完成步骤(v)后，将1体积份培养体系与2体积份所述培养基乙混合，20±2℃黑暗条件下设置转速80～100rpm振荡培养20～25天；

9、(vii)完成步骤(vi)后，将1体积份培养体系与2体积份所述培养基乙混合，20±2℃黑暗条件下设置转速80～100rpm振荡培养20～25天；

10、(viii)完成步骤(vii)后，将1体积份培养体系与2体积份所述培养基乙混合，20±2℃、黑暗、80rpm振荡培养20天；

11、(ix)将1体积份步骤(viii)得到的培养体系与4体积份培养基丙混合，20±2℃、12小时光照/12小时黑暗、80rpm振荡培养25天；

12、所述培养基甲为含1.0mg/l iaa(吲哚乙酸)、0.5mg/l tdz(噻重氮苯基脲)、20g/l蔗糖和4g/l琼脂粉的ms培养基(ms为植物细胞、组织和器官培养的常规培养基，包含大量元素、微量元素和有机物)；所述培养基乙为含0.5mg/l iaa、0.5mg/l tdz、20g/l蔗糖的mms培养基；所述培养基丙为含0.5mg/l aba(脱落酸)、0.5mg/l tdz、0.5mg/l 2,4-d(2,4-二氯苯氧基乙酸)、和50g/l蔗糖的3/4ms培养基(3/4ms是指大量元素为ms的3/4，其余微量元素不变)，其中，mms培养基是通过将ms培养基中cacl2、mgso4、kh2po4三种盐的浓度分别提高50％得到的。

13、步骤(ix)中，所述光照的条件可为1000～2000lx(蓝光)，具体可为1500lx(蓝光)。

14、本发明还提供了另一种制备鳗草体细胞胚的方法(方法乙)，包括如下步骤：

15、(1)将鳗草的胚性愈伤组织加至培养基乙中进行培养；所述培养基乙为含0.5mg/liaa、0.5mg/l tdz、20g/l蔗糖的mms培养基。其中，mms培养基是通过将ms培养基中cacl2、mgso4、kh2po4三种盐的浓度分别提高30～70％(优选提高30～50％，更优选提高50％)得到的。

16、(2)完成步骤(1)后，将培养体系转接至培养基丙中进行培养；所述培养基丙为含0.5mg/l aba、0.5mg/l tdz、0.5mg/l 2,4-d、和50g/l蔗糖的3/4ms培养基培养基。

17、方法乙中，所述鳗草的胚性愈伤组织的制备方法如下：取鳗草的茎尖，接种到培养基甲上，进行培养；所述培养基甲为含1.0mg/l iaa、0.5mg/l tdz、20g/l蔗糖和4g/l琼脂粉的ms培养基。

18、方法乙中，所述鳗草的胚性愈伤组织的制备方法如下：

19、①取鳗草的茎尖，接种到培养基甲上，培养；

20、②取步骤①得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；

21、③取步骤②得到的胚性愈伤组织，接种到所述培养基甲上，培养；

22、所述培养基甲为含1.0mg/l iaa、0.5mg/l tdz、20g/l蔗糖和4g/l琼脂粉的ms培养基。

23、所述鳗草的外植体为鳗草无菌苗的根尖或鳗草无菌苗的茎尖。所述鳗草的外植体具体如下：取鳗草无菌苗的根尖或茎尖，切成0.5cm切段。

24、①、②和③中，所述培养的条件均为：20±2℃黑暗培养20天。

25、所述步骤(1)具体包括如下步骤：

26、(1-1)将1g鳗草的胚性愈伤组织加至50ml所述培养基乙中，20±2℃、黑暗、80rpm振荡培养20天；

27、(1-2)完成步骤(1-1)后，将1体积份培养体系与2体积份所述培养基乙混合，20±2℃、黑暗、80rpm振荡培养20天；

28、(1-3)完成步骤(1-2)后，将1体积份培养体系与2体积份所述培养基乙混合，20±2℃、黑暗、80rpm振荡培养20天；

29、(1-4)完成步骤(1-3)后，将1体积份培养体系与2体积份所述培养基乙混合，20±2℃、黑暗、80rpm振荡培养20天；

30、(1-5)完成步骤(1-4)后，将1体积份培养体系与4体积份所述培养基乙混合，20±2℃、黑暗、80rpm振荡培养20天。

31、所述步骤(2)中，所述培养的条件为：20±2℃、12小时光照/12小时黑暗、振荡培养20天。

32、所述步骤(2)中，培养体系和所述培养基丙的配比为：

33、1体积份培养体系：2体积份培养基丙。

34、所述步骤(2)中，所述振荡培养具体可为80rpm振荡培养。

35、所述步骤(2)中，所述光照的条件可为1000～2000lx，具体可为1500lx，光源为蓝光。

36、本发明还保护一种扩繁鳗草的方法，包括如下步骤：将以上任一所述方法制备得到的鳗草体细胞胚放入葡甘聚糖溶液中并室温浸泡5～8min，然后转移至0.5g/100ml水fecl3溶液中并室温浸泡10min，得到人工种子；

37、将所述人工种子置于培养基丁上，20℃、12小时光照/12小时黑暗、静置培养30d；

38、所述培养基丁为含0.5mg/l naa(α-萘乙酸)+0.5mg/l 6-ba(6-苄氨基嘌呤)、1mg/l ga3(赤霉素a3)、30g/l蔗糖和7g/l琼脂的1/2ms培养基。

39、所述葡甘聚糖溶液中，葡甘聚糖的浓度可为1.0g/100ml～2.5g/100ml。

40、所述葡甘聚糖溶液具体如下：将葡甘聚糖溶于1/2ms培养基，得到2.0g/100ml的葡甘聚糖溶液。

41、所述光照的条件可为1000～2000lx，具体可为1500lx，蓝光。

42、本发明还保护一种制备鳗草体细胞胚的试剂盒，由所述培养基甲、所述培养基乙和所述培养基丙组成。

43、本发明还保护一种扩繁鳗草的试剂盒，由所述培养基甲、所述培养基乙、所述培养基丙和所述培养基丁组成。

44、本发明中，首先利用鳗草无菌苗的胚性细胞组织建立悬浮体细胞胚培养体系并优化培养条件，可以短时间内获得大量体细胞胚，进一步将体细胞胚制备为人工种子，再进一步培育人工种子得到了鳗草幼苗。本发明首次完成了鳗草从外植体高效诱导体细胞并液体悬浮培养的整个技术体系，为大规模工厂化生产提供技术，解决了鳗草种苗制备繁琐、成本较高和海洋生态保护用苗紧缺的问题。