一种选育毛蚶速生、高抗新品种的方法

本发明涉及海产经济贝类遗传育种，特别是一种选育毛蚶速生、高抗新品种的方法。

背景技术：

1、我国滩涂经济贝类众多，其中，毛蚶(scapharca subcrenata)是重要的一种，其广泛分布于我国沿海滩涂，上世纪80年代毛蚶天然储量以莱州湾、渤海湾、辽东湾、海州湾等海区最为丰富。毛蚶富含呈味氨基酸和维生素b12，肉质鲜美，具有较高的营养价值和药用价值，深受广大消费者的喜爱。近年来，随着人们生活水平的提高，对毛蚶等海珍品的需求逐年增加。但是，目前我国毛蚶的捕捞和养殖产量逐年下降，已经无法满足市场需求，导致毛蚶的市场价格屡创新高。

2、多年来，受过度捕捞、生境破坏和海洋工程等因素影响，毛蚶的野生种群数量锐减，更甚者呈现海区荒漠化，导致现有毛蚶种群遗传多样性显著降低，抗逆性下降。其次，毛蚶全人工养殖推广过程中良种培育意识淡薄，不规范的繁育技术导致毛蚶养殖品种性状退化，养殖的可持续性受到影响。此外，海洋环境污染加剧、海水质量恶化以及全球气候变化引起的海水温度升高等因素，导致夏季高温季节弧菌病害频发，引起毛蚶等贝类大规模死亡事件屡有发生。已有资料显示，每年由弧菌等病原微生物引发的贝类死亡导致的经济损失高达20-30亿元。综上，毛蚶抗逆品种和优质苗种的缺乏，已经成为制约毛蚶种业和养殖业健康发展的瓶颈问题。因此，我们亟需通过现代育种技术培育出耐高温和抗病的毛蚶新品种，以满足毛蚶育苗和养殖等快速产业发展的需要。

技术实现思路

1、本发明针对毛蚶育苗和养殖等产业缺乏优良品种及现有养殖品种抗逆性差、养殖死亡率高等问题，提出一种选育毛蚶速生、高抗新品种的方法。

2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

3、一种选育毛蚶速生、高抗新品种的方法，将耐高温和抗弧菌的毛蚶种贝分别培育至性腺发育成熟，将成熟的抗弧菌的毛蚶诱导产卵前注射灭活的副溶血弧菌诱导毛蚶产生可遗传的免疫因子，进而诱导产卵孵化；将成熟的耐高温毛蚶种贝诱导产卵子代d形幼虫继续高温驯化至附着变态；而后将上述各幼虫进行“北育南养”的方式繁育和养殖直至成熟，再将各性能的成熟毛蚶分别重复各自性能的养殖方式直至获的遗传稳定、性能优良的品种，再将获得两品种进行品系间杂交育种，即获得速生、高抗新品种的毛蚶。

4、所述耐高温的毛蚶种贝为利用半致死高温菌胁迫毛蚶成体，即获得；所述抗弧菌的毛蚶种贝为半致死浓度的副溶血弧菌胁迫毛蚶成体，即获得。

5、进一步的说，

6、1)毛蚶耐高温和抗弧菌种贝筛选：选取成体毛蚶分为两组，一组进行96小时高温半致死温度的胁迫，另一组进行副溶血弧菌感染96小时半致死浓度的胁迫，待各组毛蚶死亡率接近85％时，停止胁迫并将毛蚶置于常规养殖海水中恢复健康，然后以8％的留种率挑选个体大、健康无损的毛蚶作为种贝分别繁育下一代；

7、2)免疫因子增强：将上述获得抗弧菌毛蚶种贝培育至性腺发育成熟，并于诱导产卵前注射灭活的副溶血弧菌诱导毛蚶产生可遗传的免疫因子，然后通过阴干结合升温海水刺激方法诱导毛蚶产卵，即为，毛蚶f1代抗弧菌品系；

8、3)毛蚶浮游幼虫高温驯化：将上述筛选的耐高温毛蚶种贝培育至性腺发育成熟，采用阴干结合升温海水刺激方法诱导产卵，建立毛蚶f1代耐高温新品系；孵化后选育的d形幼虫在28±0.5℃的养殖水温下驯化，待毛蚶苗种运往开放海域中培前停止高温驯化；

9、4)采用“北育南养”的繁育和养殖技术快速培育毛蚶至性成熟：将上述步骤2)和步骤3)分别获得毛蚶幼虫在北方育苗场室内分别培育至10-15万粒/斤的稚贝，然后将毛蚶稚贝运至南方沿海滩涂进行中间培育和养成至性成熟；

10、5)新品种选育：将上述养殖后各性状品种再分别重复对应的上述步骤选育直至获的遗传稳定、性状良好的各性状品种，即，毛蚶速生、耐高温品种和毛蚶速生、抗弧菌品种；

11、6)毛蚶速生、高抗新品种选育：将上述获得的毛蚶速生、耐高温品种和毛蚶速生、抗弧菌品种进行品系间杂交育种，即获得毛蚶速生、高抗品种。

12、所述步骤1)将成体毛蚶置于终浓度3×107cfu/ml副溶血弧菌的海水养殖槽中胁迫，待毛蚶死亡率接近85％时，停止胁迫并将毛蚶置于常规养殖海水中恢复健康，然后以8％的留种率挑选个体大、健康无损的毛蚶作为种贝繁育下一代。

13、所述步骤1)将成体毛蚶置于31.6℃高温海水养殖槽中胁迫，待毛蚶死亡率接近85％时，停止胁迫并将毛蚶置于常规养殖海水中恢复健康，然后以8％的留种率挑选个体大、健康无损的毛蚶作为种贝繁育下一代。

14、所述步骤2)对上述筛选的毛蚶种贝培育水体以0.5-1.0℃/天的速率升温，每连续升温2℃后稳定1天，当养殖水温升至23℃时，停止升温并保持水温稳定在23±0.5℃，直至毛蚶性腺完全发育成熟，而后对每只性腺发育成熟的毛蚶注射3×108cfu的热灭活副溶血弧菌，阴干6小时后置于加有25℃过滤海水的孵化池中诱导产卵排精，建立毛蚶f1代抗弧菌新品系。孵化后按照海水贝类幼虫培养、投放附着基和稚贝培养等常规方法培育毛蚶幼虫。

15、所述步骤3)将上述筛选的耐高温毛蚶种贝培育至性腺发育成熟，阴干6小时后置于加有27℃过滤海水的孵化池中诱导产卵排精，建立毛蚶f1代耐高温新品系；孵化后选育的d形幼虫在28±0.5℃的养殖水温下驯化，按照海水贝类幼虫培养、投放附着基和稚贝培养等常规方法培育毛蚶幼虫，待毛蚶苗种运往开放海域中培前停止高温驯化。

16、所述步骤4)将上述步骤2)和步骤3)分别获得幼虫在北方育苗场室内培育至变态附着，待毛蚶苗种生长到10～15万粒/斤后，采用冷藏车运输或保温箱加冰空运方式运到南方沿海，然后将毛蚶苗种均匀播撒在软泥滩上养殖，待毛蚶苗种在软泥滩上养殖3个月规格可达600～800粒/斤，将毛蚶大规格苗种转移至附近池塘底播养殖，直至性成熟，用于胁迫处理和繁育下一代。

17、所述南北运输过程中运输温度控制在15℃或以下，运输时间在20小时内为宜。

18、所述步骤6)挑选上述毛蚶速生、耐高温新品种中的雌性个体(或雄性个体)和毛蚶速生、抗弧菌新品种中的雄性个体(或雌性个体)，阴干6小时后置于加有25℃过滤海水的孵化池中诱导产卵排精，进行品系间杂交，其杂交后代即为毛蚶速生、高抗新品种。

19、上述，副溶血弧菌感染96小时半致死浓度的胁迫时浓度的确认：副溶血弧菌浓度梯度为5×103cfu/ml、5×104cfu/ml、5×105cfu/ml、5×106cfu/ml、5×107cfu/ml、5×108cfu/ml，常规海水养殖作为对照组，每组设置3个重复，每个重复60枚成体毛蚶，胁迫实验持续4天，确定成体毛蚶96小时副溶血弧菌半致死浓度为3×107cfu/ml。

20、其中，副溶血弧菌为pl2菌株，其由青岛农业大学馈赠，同时文献lin,j.,ning,j.,lu,x.,chen,m.,cao,w.,wang,c.,2020.transcriptomic analysis and expression ofc-type lectins in response to vibrio parahaemolyticus challenge in scapharcasubcrenata.fish&shellfish immunology.106,365-373.中由相应描述。

21、所述96小时高温半致死温度的胁迫时温度的确定：设置不同温度梯度为22℃(对照组)、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃和34℃，常规海水养殖作为对照组，每组设置3个重复，每个重复60枚成体毛蚶，胁迫实验持续4天，确定成体毛蚶96小时高温半致死温度为31.6℃。

22、所述灭活副溶血弧菌注射浓度的确定：设置3×105cfu、3×106cfu、3×107cfu、3×108cfu、3×109cfu的热灭活副溶血弧菌注射组，注射pbs作为对照组，每组设置3个重复，每个重复60枚成体毛蚶，实验持续4天，通过细胞吞噬和凋亡、免疫酶活及基因表达等指标变化，确定有效致敏成体毛蚶的灭活副溶血弧菌注射浓度为3×108cfu。

23、本发明所具有的优点：

24、(1)本发明采用传统胁迫育种和现代分子辅助育种相结合的育种技术方案，实现了目标性状的精准育种。

25、(2)利用跨代免疫致方法显著提高子代的抗弧菌能力，采用高温驯化浮游幼虫的方法可显著增强毛蚶子代的耐高温性能，然后采用品系间杂交育种技术，显著增强了毛蚶高抗新品系的耐高温和抗弧菌能力。

26、(3)本发明采用“北育南养”的毛蚶苗种繁育和养殖技术，充分利用了南方沿海泥滩和池塘水温高、饵料充足、敌害生物少的优势，可显著提高毛蚶的生长速度，毛蚶苗种养殖12个月达到性成熟，可用于繁育下一代，显著缩短了育种周期。