L-乙酰肉碱提升香港牡蛎繁殖性能的方法和应用

【】本发明涉及水产养殖，特别涉及l-乙酰肉碱提升香港牡蛎繁殖性能的方法和应用。

背景技术

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背景技术：

1、香港牡蛎(crassostrea hongkongensis)，俗称大蚝，主要分布于河流入海口的咸淡水交汇区，是我国南方沿海最主要的养殖经济贝类之一。在人类开发和气候变化的双重因素影响下，自然海区香港牡蛎亲本的繁殖性能日益退化，主要表现为雌雄配子自然排放障碍、受精率低、孵化率低、畸形率高和孵化d型幼虫数剧烈减少，进而导致种质资源的退化。可以说，繁殖性能的日益退化已经严重威胁了香港牡蛎野生资源存续和香港牡蛎养殖业发展。

2、针对香港牡蛎雌雄配子自然排放障碍问题，在人工育苗生产实践中，通常是采用解剖采集精卵再进行人工授精孵化的方法，虽然解决了排放障碍问题，但是由于解剖所得的精卵，成熟度不一致，依然导致其受精率低、孵化率低、畸形率高以及孵化d型幼虫数较少，孵化效率低下。

3、在我国北方，已有方法通过升温和营养强化的方式，来促熟长牡蛎性腺，从而提高成熟度，并取得了较好的孵化效果。但是，生长于两广的香港牡蛎本身就长期生活于较高的水温中，也就是生物学零度更高，升温的幅度有限，升温促熟效果较差。而营养强化也需要在较低的水温中才能起到更好的效果，在华南水温较高的情况下并不适合，主要原因一是因为两广水温高，香港牡蛎代谢快，不容易积累营养并转化为繁殖性能。二是在水温高的情况下，如果投放一些如蛋黄、淀粉、酵母菌类、裂殖壶菌等高营养物质时，水质会马上腐败变差，不但起不到营养强化的效果，反而会造成大量死亡。

4、l-乙酰肉碱是一种重要的肉碱衍生物，由意大利sigma-tau公司开发。1986年上市，用于治疗中枢神经系统疾病、代谢性疾病、痴呆和脑老化等。l-乙酰肉碱在体内还可以转变为其他的肉碱化合物，从而发挥重要作用。此外，l-乙酰肉碱具有一定的抗氧化功能，抗衰老功能，具有保护卵子、精子等细胞的可能性，但是目前现有技术中并无l-乙酰肉碱在提升牡蛎生殖性能上的报道，但是基于其抗氧化能力，并有提升牡蛎繁殖性能，提升卵细胞存活率的可能，可用于加工成促进香港牡蛎繁殖的促进剂。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、鉴于上述内容，针对现有技术的不足，本发明提供了一种使用l-乙酰肉碱短期内提升香港牡蛎繁殖性能的全新方法，解决了解剖采集精卵繁殖效率低，以及传统升温和营养强化方法不适合南方香港牡蛎人工育苗应用的问题，因地制宜，有效提升香港牡蛎亲本以及配子的繁殖性能，从而极大提升了孵化效率。

2、为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、l-乙酰肉碱在提升香港牡蛎繁殖性能的应用，所述l-乙酰肉碱浓度为100mg/l-150mg/l。

4、本发明还包括应用如权利要求1所述l-乙酰肉碱提升香港牡蛎繁殖性能的方法，所述方法包括利用l-乙酰肉碱对香港牡蛎亲本进行处理和/或利用l-乙酰肉碱对香港牡蛎配子进行处理；所述l-乙酰肉碱的浓度为100mg/l-150mg/l；所述香港牡蛎亲本处理时的海水盐度为12‰；所述香港牡蛎配子进行处理时采用精子卵子混合浸泡处理。

5、进一步的，所述对香港牡蛎亲本进行处理的方法包括如下具体步骤：

6、s1、采集并暂养香港牡蛎亲本：采集处于繁殖盛期的香港牡蛎亲本装入养殖笼并放在养殖池内暂养；

7、s2、处理前准备：提前准备3个加有新鲜过滤海水的水泥池，并将3个水泥池的海水盐度调至12‰，提前在第1个水泥池中加入l-乙酰肉碱，并浓度调至150mg/l；

8、s3、l-乙酰肉碱处理：将步骤s1的香港牡蛎亲本放入步骤s2的第1个水泥池中进行处理，处理24h；在第2个水泥池中加入l-乙酰肉碱，并浓度调至150mg/l，将处理24h后的亲本牡蛎放入第2个水泥池，处理48h；在第3个水泥池中加入l-乙酰肉碱，并浓度调至150mg/l，将处理24h后的亲本牡蛎放入第3个水泥池，处理24h，总处理时间为72h；处理时香港牡蛎亲本投放密度为150-250kg/m3；

9、s4、人工繁育：将处理后的香港牡蛎亲本全部解剖并辨别雌雄后，采取传统方法进行人工授精孵化，孵化时的海水盐度为12‰。

10、进一步的，所述s2步骤的海水温度为27℃-30℃。

11、进一步的，所述香港牡蛎配子进行处理的方法包括如下具体步骤：

12、①获得香港牡蛎的配子：经过室内暂养3-15天的并处于繁殖期的香港牡蛎亲本，在辨别雌雄后，分别解剖获得精和卵；

13、②l-乙酰肉碱处理：将精卵进行分别定量后混合并静置10分钟，然后将精卵混合液转移至盛有盐度为12‰的l-乙酰肉碱处理液的容器中，容器中l-乙酰肉碱终浓度为100mg/l，处理时间为15分钟；

14、③洗脱：步骤②处理15分钟后，迅速用400目筛绢对步骤②的精卵混合物进行洗脱，洗去处理液；

15、④孵化：对步骤③洗脱后的精卵混合物放入盐度为12‰的海水中进行孵化。

16、进一步的，所述步骤②精卵定量的方法为用盐度为12‰，水温为30℃的海水分别对精子和卵进行稀释，最终得到精子母液和卵母液，其中，卵母液的密度为50个/ml、总体积为10l；精子母液的密度为102-103个/微升、总体积为10l。

17、进一步的，所述步骤②精和卵混合时的混合比例是精与卵的数量比例为5-10:1。

18、进一步的，所述步骤④的孵化温度为27℃-30℃。

19、在本发明中s2步骤的密度与海水温度有如下对应关系：

20、 水温 27℃ 28℃ 29℃ 30℃ 密度 <![cdata[250kg/m³]]> <![cdata[225kg/m³]]> <![cdata[200kg/m³]]> <![cdata[150kg/m³]]>

21、本发明具有如下有益效果：

22、1、本发明通过使用适宜浓度的l-乙酰肉碱，在适宜的海水盐度下，短期处理香港牡蛎的亲本，以及在适宜的方法下，处理香港牡蛎的配子，两种方式分别显著提升了香港牡蛎繁殖性能，在香港牡蛎人工育苗生产中极大的提高了孵化效率。实验数据表明，浓度为150mg/l的l-乙酰肉碱，在12‰海水盐度下，处理香港牡蛎亲本，再进行解剖人工授精孵化后，其繁殖性能达到最优，其受精率达到90.92％，比对照组提升了94.86％，孵化率达到71.88％，比对照组提升了3.42倍，孵化出来的d型幼虫畸形率与对照组无差异；而在处理香港牡蛎配子的方法中，在精卵混合后再用100mg/l浓度的l-乙酰肉碱处理的处理15分钟的方法下，香港牡蛎胚胎的受精率达到82.40％，比对照组提升了81.86％，孵化率达到88.95％，比对照组提升了78.69％，孵化出来的d型幼虫畸形率为6.17％，比对照组降低了89.09％。