用于保存生物样品的新型过冷方法与流程

背景技术：

1、差的冷冻保存是再生医疗中要解决的关键瓶颈。随着细胞和组织疗法转化为关键性试验和商业制造，运输新鲜的起始生物材料和最终药物产品的物流已证明是关键障碍。这些治疗的成功的关键是在零下温度下长期贮存后提供高且可再现水平的存活和恢复的系统。细胞和组织疗法的低温保存(或冷冻保存)对于早期临床试验、给药前的长期贮存、以及集中制造并且在大型患者网络中分配的晚期治疗是必须的。以细胞悬液或移植组织来施用的这样的疗法需要使用作为与细胞相容、对受试者无毒、并且适用于在施用前以高存活率和功能将治疗保存足够长的时间的媒介的冷冻保护液。

2、冷冻保存技术老旧、有毒且通常细胞解冻后的存活率低于50％为无效的，并且效力不可靠，这极大的阻碍了标准化运输、批量制造、时序安排、和终产物释放试验。例如dmso等的冷冻保存试剂(cpa)的广泛使用通过阻止冰生长改善了冷冻保存的生物样品解冻后的存活率，但由于dmso对细胞产物及其后对治疗的患者有毒，阻止了按需生物库和先进再生药物产品的实现。参见，sauer-heilborn等人，transfusion,44(6)：907-16(20040；hubel,transfusion,41(5)：579-580(2001)。解冻后去除dmso为低效的且恢复率保持小于60％。参见，calmels等人，bone marrow transplant,31(9)：823-828(2000)。作为强溶剂，dmso溶解并浸出输液管和容器，这增加了cgmp过程的风险。动物和人源血清(例如，胎牛血清，fbs)作为具有不确定结构和组成的天然产物，引入批次间的变化、另外的生物危害，并且极大地受供应链问题和地理限制的影响。其他冷冻介质可含有不稳定的蛋白质导致贮存寿命缩短、或化学上未定义为单一产品的聚合物。fda试图通过适当的替代品来限制dmso和血清的使用，这对于实现高效且现成的细胞和组织产品的强大的基础设施是必需的。

3、因此，本领域需要用于以高存活率和功能保存基于细胞和组织的样品的无毒且高活性的防冰材料。本公开满足了该需求并且还提供了其它优点。

技术实现思路

1、在一些方面，本文提供了一种以改善的细胞存活率冷冻保存细胞群的方法，所述方法包括：

2、(a)将细胞群与含有一个或多个极性类肽单体的类肽聚合物或其盐接触；并且

3、(b)将细胞群冷却至0℃至约-20℃的温度至少约3小时的时间段以产生过冷细胞群(population of supercooled cells)，

4、其中所述过冷细胞群的至少约50％在复温至高于0℃后存活。

5、在一些实施方案中，通过将冷冻保存方法存活的细胞数与起始细胞数比较以计算复温后存活的过冷细胞群的百分比。在一些实施方案中，通过将过冷方法存活的细胞数归一化至预先确定的未冷冻细胞的细胞计数(例如，起始细胞数)来计算复温后存活的过冷细胞群的百分比。在特定实施方案中，通过确定复温后约1天以下(例如，约4、8、12、16、或20小时)的冷冻保存方法存活的细胞数来计算过冷细胞群的百分比。

6、在一些实施方案中，将细胞群冷却至约-5℃至约-20℃、约-6℃至约-20℃、约-7℃至约-20℃、约-10℃至约-20℃、或约-15℃至约-20℃的温度。在其他实施方案中，将细胞群冷却至0℃至约-15℃、0℃至约-10℃、或0℃至约-5℃的温度。在进一步的实施方案中，将细胞群冷却至约-5℃至约-15℃、约-5℃至约-10℃、约-6℃至约-15℃、约-7℃至约-15℃、或约-10℃至约-15℃的温度。在特定实施方案中，将细胞群冷却至约0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃、-10℃、-11℃、-12℃、-13℃、-14℃、-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃、或-20℃的温度。在一些实施方案中，冷却的细胞群在所述温度下未冷冻(例如，在液体、无冰悬浮液中)。

7、在一些实施方案中，将细胞群冷却至少约4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、或120小时的时间段。在其他实施方案中，将细胞群冷却约1至约10天、约2至约10天、约3至约10天、约4至约10天、约5至约10天、约1至约8天、约2至约8天、约3至约8天、约4至约8天、约5至约8天、约1至约5天、约2至约5天、约3至约5天、约4至约5天、约2至约4天、约2至约3天、或约3至约4天的时间段。在进一步实施方案中，将细胞群冷却至少约5天(例如，至少约6、7、8、9、或10天)的时间段。在特定实施方案中，将细胞群冷却约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24天的时间段。

8、在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约50％在复温至高于约5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、或35℃的温度后存活。在其他实施方案中，过冷细胞群的至少50％在复温至约1℃至约37℃、约5℃至约37℃、约10℃至约37℃、约15℃至约37℃、约20℃至约37℃、约25℃至约37℃、约30℃至约37℃、约35℃至约37℃、约1℃至约35℃、约10℃至约35℃、约20℃至约35℃、约30℃至约35℃、约1℃至约30℃、约10℃至约30℃、约20℃至约30℃、约1℃至约25℃、约10℃至约25℃、约20℃至约25℃、约1℃至约20℃、约10℃至约20℃、约1℃至约15℃、约10℃至约15℃、约1℃至约10℃、约5℃至约10℃、或约1℃至约5℃的温度后存活。在特定实施方案中，过冷细胞群的至少50％在复温至约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、或37℃温度后存活。

9、在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约55％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约60％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约65％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约70％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约75％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约80％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约85％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约90％在复温后存活。在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约95％在复温后存活。

10、在一些实施方案中，过冷细胞群的至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％)在复温后存活至少1天。在其他实施方案中，过冷细胞群的至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％)在复温后存活约1至约10天、约2至约10天、约3至约10天、约4至约10天、约5至约10天、约1至约8天、约2至约8天、约3至约8天、约4至约8天、约5至约8天、约1至约5天、约2至约5天、约3至约5天、约4至约5天、约2至约4天、约2至约3天、或约3至约4天的时间段。在进一步实施方案中，过冷细胞群的至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％)在复温后存活至少约2天(例如，至少约3、4、5、6、或7天)。在特定实施方案中，过冷细胞群的至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％)在复温后存活约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24天。

11、在一些实施方案中，改善的细胞存活率包括与对照过冷细胞群相比，在复温后存活的过冷细胞群的增殖增强。在一些实施方案中，对照过冷细胞群不与类肽聚合物接触(例如，对照过冷细胞群仅与冷冻保护液(仅含有dmso、或细胞培养基的溶液)接触培养基)。在特定实施方案中，在复温后特定时间点(例如，约在复温后1、2、3、4、5、6、或7天以上)过冷细胞群中的细胞数比该时间点对照过冷细胞群的细胞数大至少约1倍(例如，至少约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍更大)。作为非限定性实例，在复温后约3天过冷细胞群中的细胞数可比对照过冷细胞群中的细胞数大至少约1倍。作为另一个非限定性实例，在复温后约6天过冷细胞群中的细胞数比对照过冷细胞群中的细胞数大至少约2倍。

12、在相关方面中，本文提供了一种以改善的细胞存活率冷冻保存细胞群的方法，所述方法包括：

13、(a)将细胞群与含有一个或多个极性类肽单体的类肽聚合物或其盐接触；并且

14、(b)将细胞群冷却至0℃至约-20℃的温度至少约3小时的时间段以产生过冷细胞群，

15、其中所述改善的细胞存活率包括与对照过冷细胞群相比，在复温后存活的过冷细胞群的增殖增强。

16、在一些实施方案中，对照过冷细胞群不与类肽聚合物接触(例如，对照过冷细胞群仅与冷冻保护液(仅含有dmso、或细胞培养基的溶液)接触培养基)。在特定实施方案中，在复温后特定时间点(例如，在复温后约1、2、3、4、5、6、或7天以上)过冷细胞群中的细胞数比该时间点对照过冷细胞群的细胞数大至少约1倍(例如，至少约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍更大)。例如，在上文[0007]和[0012]段中描述了涉及本发明的这些方面的进一步的实施方案。

17、在一些实施方案中，类肽聚合物以足以在细胞群冷却的温度下减少或抑制冰晶形成的量存在。在特定实例中，类肽聚合物以约100nm和约1000mm之间的量存在，例如，在约100nm和约100mm之间。

18、在一些实施方案中，细胞群包括组织或器官。在一些实施方案中，细胞群包括原代细胞。在特定实施方案中，细胞群选自由以下组成的组：心脏细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、神经细胞、血细胞、免疫细胞、成纤维细胞、生殖泌尿细胞、骨细胞、干细胞、精细胞、卵母细胞、胚胎细胞、上皮细胞、内皮细胞、及其组合。生殖泌尿细胞的非限定性实例包括阴茎海绵体细胞，例如阴茎海绵体平滑肌细胞、阴茎海绵体上皮细胞、及其组合。

19、在一些实施方案中，所述方法进一步包括：

20、(c)将过冷细胞群复温至高于0℃。

21、在一些实施方案中，类肽聚合物包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多的极性类肽单体。在一些实施方案中，所述极性类肽单体具有含羟基的独立选择的侧链。在一些实施方案中，所述独立选择的侧链为任选取代的c1-18羟基烷基。在一些实施方案中，所述c1-18羟基烷基为独立选择的任选取代的c1-6羟基烷基。在特定实例中，所述极性类肽单体的一个或多个或全部侧链具有以下结构：

22、

23、极性类肽单体的非限定性实例包括：

24、

25、

26、

27、

28、其中下标m为重复单元的数量且在1和10之间(例如，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在一些实施方案中，所述重复单元，m可在1和2、1和3、1和4、1和5、1和6、1和7、1和8、1和9、或1和10之间。

29、在一些实施方案中，所述类肽聚合物进一步包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多的疏水性类肽单体。疏水性类肽单体的非限定性实例包括：

30、

31、

32、其中下标m为重复单元的数量且在1和10之间(例如，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。在一些实施方案中，所述重复单元m可在1和2、1和3、1和4、1和5、1和6、1和7、1和8、1和9、或1和10之间。

33、在一些实施方案中，所述类肽聚合物为含有类肽聚合物和一个或多个氨基酸的类肽-肽杂合物或其盐，其中所述一个或多个氨基酸位于所述类肽聚合物的一端或两端和/或在一个或多个类肽单体之间。

34、在一些实施方案中，所述类肽聚合物具有式(i)的结构、其互变异构体或其立体异构体：

35、

36、其中：

37、各r1独立地选自由以下组成的组：h、任选取代的c1-18烷基、任选取代的c2-18烯基、任选取代的c2-18炔基、任选取代的c1-18羟基烷基、任选取代的烷氧基、任选取代的c1-18烷基氨基、任选取代的c1-18烷硫基、任选取代的羧基烷基、c3-10环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、(c3-10环烷基)烷基、(杂环烷基)烷基、芳烷基、和杂芳烷基；

38、其中r1的至少一个实例为任选取代的c1-18羟基烷基，并且

39、其中任何环烷基、杂环烷基、芳基、和杂芳基被一个或多个r3基团任选且独立地取代；

40、各r2独立地选自由以下组成的组：h、任选取代的c1-18烷基、任选取代的c2-18烯基、任选取代的c2-18炔基、任选取代的c1-18羟基烷基、任选取代的c1-18烷基氨基、任选取代的c1-18烷硫基、和任选取代的羧基烷基；

41、各r3独立地选自由卤素、氧代基、硫代基、-oh、-sh、氨基、c1-8烷基、c1-8羟基烷基、c1-8烷基氨基和c1-8烷硫基组成的组；

42、x和y独立地选自由以下组成的组：h、任选取代的c1-8烷基、任选取代的c1-8酰基、任选取代的c1-8烷基氨基、-oh、-sh、-nh2、乙酰基、羧基、任选取代的c1-8羟基烷基、任选取代的c1-8烷基氨基、任选取代的c2-8烷硫基、任选取代的c1-8羧基烷基、和卤素，或者

43、可选地，x和y一起形成共价键；和

44、表示聚合物中的单体的数量的下标n在2和50之间。

45、在一些实施方案中，r1的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多的实例为独立选择的任选取代的c1-18羟基烷基。在一些实施方案中，所述c1-18羟基烷基为独立选择的任选取代的c1-6羟基烷基。

46、在一些实施方案中，一个或多个r1具有根据r1b所示的结构：

47、

48、在一些实施方案中，所述类肽聚合物中的r1的各个实例选自由以下组成的组：

49、

50、其中：

51、m在1和8之间；和

52、r3选自由h、c1-8烷基、卤素、羟基、巯基、硝基、胺(amine)、氧代基、和硫代基组成的组。

53、在一些实施方案中，所述类肽聚合物中的r1的各个实例选自由以下组成的组：

54、

55、在一些实施方案中，所述类肽聚合物中的r1的各个实例为c1-18羟基烷基。在一些实施方案中，r1的各个实例为c1-6羟基烷基。在一些实施方案中，r1的各个实例为相同的c1-6羟基烷基。在一些实施方案中，r1的各个实例为：

56、

57、在一些实施方案中，r2的各个实例为h。

58、在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在3和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在5和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在6和50之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在6和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在6和20之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在8和50之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在8和25之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在8和20之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物的序列长度n在10和25之间。

59、在一些实施方案中，x和y为h、任选取代的c1-8烷基氨基、-oh、-sh、羧基、任选取代的c1-8羟基烷基、任选取代的c1-8烷基氨基、任选取代的c2-8烷硫基、任选取代的c1-8羧基烷基、或卤素。

60、在一些实施方案中，所述类肽聚合物的x和y一起形成共价键。

61、在一些实施方案中，所述类肽聚合物选自表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、或表10中记载的聚合物的组。

62、在一些实施方案中，所述类肽聚合物包括亚单元，所述亚单元包括一个或多个第一疏水性类肽单体h和一个或多个第一极性类肽单体p，其排列使得所述类肽聚合物具有序列[hapb]n或[pbha]n，其中：

63、表示亚单元中的连续的第一疏水性类肽单体的数量的下标a在1和10之间；

64、表示亚单元中的连续的第一极性类肽单体的数量的下标b在1和10之间；和

65、表示所述类肽聚合物中亚单元的数量的下标n在2和50之间。

66、在一些实施方案中，所述类肽聚合物进一步包括取代基x和y使得所述类肽聚合物具有序列x-[hapb]n-y或x-[pbha]n-y，其中：

67、x和y独立地选自由以下组成的组：h、任选取代的c1-8烷基、任选取代的c1-8酰基、任选取代的c1-8烷基氨基、-oh、-sh、-nh2、羧基、任选取代的c1-8羟基烷基、任选取代的c1-8烷基氨基、任选取代的c2-8烷硫基、任选取代的c1-8羧基烷基、和卤素，或者

68、可选地，x和y一起形成共价键。

69、在一些实施方案中，所述亚单元进一步包括第二疏水性类肽单体和/或第二极性类肽单体，使得所述类肽聚合物具有序列[hapbhcpd]n或[pbhapdhc]n，其中：

70、表示亚单元中的连续的第二疏水性类肽单体的数量的下标c为0和10之间；

71、表示亚单元中的连续的第二极性类肽单体的数量的下标d为0和10之间；并且

72、c和d不都为0。

73、在一些实施方案中，所述类肽聚合物进一步包括取代基x和y使得所述类肽聚合物具有序列x-[hapbhcpd]n-y或x-[pbhapdhc]n-y，其中：

74、x和y独立地选自由以下组成的组：h、任选取代的c1-8烷基、任选取代的c1-8酰基、任选取代的c1-8烷基氨基、-oh、-sh、-nh2、羧基、任选取代的c1-8羟基烷基、任选取代的c1-8烷基氨基、任选取代的c2-8烷硫基、任选取代的c1-8羧基烷基、和卤素，或者

75、可选地，x和y一起形成共价键。

76、在一些实施方案中，所述类肽聚合物进一步包括序列z，所述序列z包括一个或多个疏水性类肽单体和/或一个或多个极性类肽单体，其中z位于第一个亚单元之前、最后一个亚单元之后、和/或一个或多个亚单元之间。在一些情况下，z包括一个或多个疏水性类肽单体。在一些情况下，z包括一个或多个极性类肽单体。在其他实例中，z包括一个或多个疏水性类肽单体和一个或多个极性类肽单体。

77、在一些实施方案中，所述类肽聚合物包括：(a)含有两个第一疏水性类肽单体h和两个第一极性类肽单体p的亚单元，和(b)位于所述类肽聚合物的c-末端的两个第二疏水性类肽单体，其排列使得所述类肽单体具有序列[h2p2]nh2或[p2h2]nh2，其中表示所述类肽聚合物中的亚单元的数量的下标n在1和50之间。在一些实施方案中，所述类肽聚合物包括化合物81。

78、在一些实施方案中，所述类肽聚合物进一步包括取代基x和y使得所述类肽聚合物具有序列x-[h2p2]nh2-y或x-[p2h2]nh2-y，其中x和y独立地选自由以下组成的组：h、任选取代的c1-8烷基、任选取代的c1-8酰基、任选取代的c1-8烷基氨基、-oh、-sh、-nh2、羧基、任选取代的c1-8羟基烷基、任选取代的c1-8烷基氨基、任选取代的c2-8烷硫基、任选取代的c1-8羧基烷基、和卤素，或者可选地，x和y一起形成共价键。在一些实施方案中，n在1和10之间。

79、在一些实施方案中，所述第一和/或第二疏水性类肽单体独立地选自上述记载的疏水性类肽单体。在一些实施方案中，所述类肽聚合物包括具有含羟基的侧链的极性类肽单体。在一些实施方案中，所述第一和/或的人极性类肽单体独立地选自上述记载的极性类肽单体。

80、在一些实施方案中，第一和/或第二极性类肽单体各自包括侧链，所述侧链独立地选自由(c1-6烷氧基)(c1-6亚烷基)、(低聚[乙二醇])、(4-至10-元杂环烷基)(c1-6亚烷基)、和(5-至10-元杂芳基)(c1-6亚烷基)组成的组。在一些实施方案中，(4-至10-元杂环烷基)(c1-6亚烷基)包括4-6元杂环，其中至少一个成员选自由o和n组成的组。在一些实施方案中，(4-至10-元杂环烷基)(c1-6亚烷基)包括四氢呋喃基或氧代吡咯烷基部分。在一些实例中，类肽聚合物包括在特定实例中，极性类肽单体全部为为在一些实施方案中，所述类肽聚合物包括化合物63、化合物76、化合物86、或化合物87。

81、在一些实施方案中，(5-至10-元杂芳基)(c1-6亚烷基)包括5-6元芳族环，其中至少一个环成员选自由o和n组成的组。在一些实施方案中，(5-至10-元杂芳基)(c1-6亚烷基)包括呋喃基部分。在一些实例中，类肽聚合物包括在特定实例中，类肽聚合物包括化合物73。

82、在一些实施方案中，侧链包括甲氧基乙基。在一些实例中，类肽聚合物包括在特定实例中，类肽聚合物包括化合物62。

83、在一些实施方案中，侧链包括低聚(乙二醇)部分。在一些实施方案中，低聚(乙二醇)部分为2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基部分。在一些实例中，类肽聚合物包括在特定实例中，类肽聚合物包括化合物67。

84、在一些实施方案中，n在2和10之间。在一些实施方案中，a在1和5之间。在一些实施方案中，b在1和5之间。在一些实施方案中，a在1和3之间且b在1和3之间。在一些实施方案中，c在0和5之间。在一些实施方案中，d在0和5之间。

85、在一些实施方案中，所述类肽单体的约10％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约20％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约30％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约40％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约50％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约60％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约70％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约80％为疏水性的。在一些实施方案中，所述类肽单体的约90％为疏水性的。

86、在一些实施方案中，所述类肽聚合物或类肽-肽杂合物为盐形式。盐的非限定实例包括本文所述的类肽聚合物和类肽-肽杂合物的盐酸盐、乙酸盐、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、酒石酸盐、和葡糖酸盐。

87、在一些实施方案中，将所述类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物配制在冷冻保护液中。在一些实施方案中，所述冷冻保护液进一步包括选自由以下组成的组的化合物：离子性物质、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂、抗氧化剂、细胞膜稳定化合物、水通道蛋白或其它通道形成化合物、醇、糖、糖衍生物、非离子表面活性剂、蛋白质、二甲基亚砜(dmso)、聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、透明质酸、甲酰胺、天然或合成水凝胶、及其组合。

88、在一些实施方案中，冷冻保护液进一步包括选自由以下组成的组的醇：丙二醇、乙二醇、甘油、甲醇、丁二醇、阿东糖醇、乙醇、三亚甲基醇、二甘醇、聚环氧乙烷、赤藓糖醇、山梨醇、木糖醇、聚丙二醇、2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)、甘露醇、肌醇、二硫糖醇、1,2-丙二醇、及其组合。

89、在一些实施方案中，冷冻保护液进一步包括选自由单糖、二糖、多糖、及其组合组成的组的糖。在一些实例中，糖为选自由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、甘露糖、3-o-甲基-d-吡喃葡萄糖、及其组合组成的组的单糖。在其它实例中，糖为选自由蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、及其组合组成的组的二糖。仍在其它实例中，糖为选自由棉子糖、葡聚糖、及其组合组成的组的多糖。

90、在一些实施方案中，冷冻保护液进一步包括具有小于约3,000g/mol的平均分子量的peg或ppg。在特定实例中，peg或ppg具有约200g/mol和400g/mol之间的平均分子量。

91、在一些实施方案中，所述冷冻保护液进一步包括选自由牛血清白蛋白、人血清白蛋白、明胶、及其组合组成的组的蛋白质。在一些实施方案中，所述冷冻保护液进一步包括含有壳聚糖、透明质酸、或其组合的天然或合成水凝胶。在一些实施方案中，所述冷冻保护液进一步包括选自由聚氧乙烯月桂基醚、聚山梨酸酯80、及其组合组成的组的非离子表面活性剂。

92、在其他方面，本文提供了通过任何本文所述方法产生的具有改善的细胞存活率的过冷细胞群。

93、从下面的详细描述和附图中，本发明的其他用途、特征、和优点对于本领域技术人员将是显而易见的。