一种促进雷公藤毛状根诱导的方法

本发明通过不同方式处理雷公藤外植体，获得雷公藤毛状根快速诱导的方法，包括雷公藤外植体的处理、发根农杆菌accc10060的菌液活化培养、accc10060对雷公藤外植体的毛状根诱导等。本发明的诱导方法简单，明显缩短了雷公藤毛状根的诱导时间并提高了雷公藤毛状根的诱导率。本发明属于生物工程。

背景技术：

1、中药雷公藤为卫矛科植物雷公藤的干燥根，主要分布在我国长江以南，主产于福建、浙江、安徽、湖南等地，具有清热解毒、活血化瘀、杀虫止血、消肿散结等功效。近年来，人们对药用植物雷公藤重要活性成分的需求日益增加，造成野生雷公藤资源的过度开发，使其资源面临枯竭。此外，由于雷公藤具有大毒，不适合大面积种植，加之环境因素限制，提取量十分有限，远远无法满足人们现阶段对其的需求。毛状根具有生长周期短且不受自然环境的影响、次生代谢产物含量高且稳定、遗传稳定性强、培养条件简单等特点，因此毛状根培养技术成为一条可靠的生产植物次生代谢产物的有效途径，有望成为雷公藤活性成分的重要来源。

2、white和nester的研究发现发根农杆菌通过将其ri质粒上的t-dna转移并整合到植物基因组中，进而诱导植物产生毛状根(white f f,nester e w.hair root:plasmidencodes virulence traits in agrobacterium rhizogenes[j].journal ofbacteriology,1980,141(3):1134-1141.)，这极大地促进了毛状根诱导的研究，为今后优化毛状根诱导转化体系奠定了基础。迄今为止已有近200种植物成功诱导出毛状根，转化成功的植物大部分为十字花科、菊科、茄科、豆科等，主要是双子叶植物，且多为草本植物(刘连旺,张永清,李先恩.药用植物毛状根研究进展[j].山东中医药大学学报,2015,39(03):288-291.)。陈新玲等构建了蚬壳花椒毛状根的诱导及其培养技术体系，比较了3种发根农杆菌菌株的毛状根诱导率，并对外植体类型、侵染时间和培养基类型进行优化(陈新玲,王媛,孙吉康,等.蚬壳花椒毛状根的诱导及其培养技术体系构建[j].植物生理学报,2023,59(11):2117-2125.)。王雨晴等人比较了不同发根农杆菌菌株的毛状根诱导能力及不同培养基、不同转速下毛状根的生长能力，最终建立了高产总皂苷的绞股蓝毛状根诱导体系(王雨晴,杨谨,黄娴,等.发根农杆菌诱导绞股蓝毛状根及其总皂苷含量测定[j].中药材,2022,45(08):1818-1821.)。然而关于雷公藤毛状根诱导的研究较少，封磊等人通过发根农杆菌对雷公藤的嫩茎与叶片外植体进行诱导发根，约30天后在外植体的创伤部位可见有毛状根长出，其中叶片的诱导率为31.4％(封磊.一种利用发根农杆菌诱导产生雷公藤毛状根的方法.cn102321664b[p].2013.04.17)；霍彦波对雷公藤叶片进行毛状根诱导，发现除菌继代28天～42天后，叶片才开始长出毛状根(霍彦波.杀虫化合物雷公藤内酯醇生物合成关键基因twtps27a/b的转录调控研究[d].西北农林科技大学,2021.)。

3、综上所述，雷公藤毛状根的诱导率较低且周期较长，有必要建立和优化雷公藤毛状根的诱导体系，不仅可以用于药用植物的品种改良，以此获得高产活性成分的再生植株，缓解雷公藤野生资源紧张的问题，还可以为今后基于雷公藤毛状根体系的遗传与代谢工程的科学研究奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的，在于提供一种促进雷公藤毛状根诱导的方法，所述方法能够简单有效，毛状根诱导速度快，诱导率高。

2、具体地，本发明所述促进雷公藤毛状根诱导的方法包括：

3、雷公藤外植体的预培养，包括：处理雷公藤外植体，于无菌环境中，将预处理的雷公藤外植体置于ms+2,4-二氯苯氧乙酸+激动素的固体培养基中，25-30℃恒温培养2～4d；

4、菌液的活化：包括，将农杆菌接种到yeb液体培养基中，25-30℃恒温培养至其od600约为0.2-1.0，离心收集菌体，将菌体用ms液体培养基继续重悬，得到活化的菌液；

5、侵染与共培养：将预培养处理的雷公藤外植体至重悬的活化菌液中，25-30℃恒温培养振荡器中振荡培养10-20min，除去雷公藤外植体表面残留菌液，转移到ms+2,4-二氯苯氧乙酸+激动素+乙酰丁香酮的固体培养基中继续与25-30℃下恒温培养1-5d；

6、除菌继代：共培养后的雷公藤外植体经清洗处理后，转移至含有特美汀的ms固体培养基上，继代培养，获得雷公藤外植体经诱导后的毛状根。

7、本发明的一个具体实施方案中，所述雷公藤外植体为雷公藤幼苗的叶片或幼茎，所述叶片剪成1cm2左右的方形小片，所述幼茎剪成1cm左右的茎段，在所述方形小叶片上，优选地可以是在叶片表面扎出一定数量的伤口，如3个、5个、8个、10个、12个、或5个左右的伤口。

8、本发明的一个具体实施方案中，所述yeb液体培养基的组成包括：5g/l蛋白胨、5g/l蔗糖、5g/l牛肉膏、1g/l yeast extract、4g/l mgso4.7h2o，其中固体培养基加15g/l琼脂粉，液体培养基不加，ph为7.4，在121℃条件下高温灭菌20min。

9、本发明的一个具体实施方案中，所述ms液体培养基的组成包括：4.43g/l ms、30g/l蔗糖，其中固体培养基加15g/l琼脂粉，液体培养基不加，ph为5.8，在121℃条件下高温灭菌20min。

10、本发明所述方法，在所述除菌继代培养过程中，每14d继代一次，42d统计毛状根诱导率。

11、本发明的一个优选的实施方案中，在所述除菌继代过程中，培养基中进一步含有激素，如植物生长激素，所述激素选自2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚-3-丁酸、6-苄氨基嘌呤、激动素或赤霉素，优选为2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚-3-丁酸，更优选为吲哚-3-丁酸；所述激素的浓度为0.1-5mg/l，优选为1mg/l。

12、本发明更为优选的一个实施方案中，其中在所述侵染与共培养过程中，所述固体培养基中还可进一步含有浓度为0.1-5mg/l的激素吲哚-3-丁酸，优选为1mg/l。

13、本发明一个具体的促进雷公藤毛状根诱导的方法包括：

14、雷公藤外植体的预培养，包括：处理雷公藤外植体，于无菌环境中，将预处理的雷公藤外植体置于ms+1mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸+0.1mg/l的激动素的固体培养基中，25℃恒温培养3d；

15、菌液的活化：包括，将农杆菌accc10060接种到yeb液体培养基中，28℃恒温培养至其od600约为0.4-0.6，离心收集菌体，将菌体用ms液体培养基继续重悬，得到活化的accc10060农杆菌菌液；

16、侵染与共培养：将预培养处理的雷公藤外植体至重悬活化的农杆菌菌液中，28℃恒温培养振荡器、120rpm下振荡培养15min，除去雷公藤外植体表面残留菌液，转移到ms+1mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸+0.1mg/l的激动素+100μmol/l的乙酰丁香酮的固体培养基中继续于25℃下恒温培养3d；

17、除菌继代：共培养后的雷公藤外植体经清洗处理后，转移至含有特美汀的ms固体培养基上，继代培养，14d继代一次，42d统计获得的雷公藤毛状根诱导率；所述固体培养基中含有1mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸或吲哚-3-丁酸，优选吲哚-3-丁酸。

18、本发明通过accc10060发根农杆菌侵染不同外植体(雷公藤叶片、茎段)，结果发现雷公藤叶片诱导率更好。再通过不同共培养时间(1d、3d、5d)、菌液浓度(od600为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)及除菌继代阶段在固体培养基中加入不同激素(1mg/l 2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸，生长素类激素调节剂)、1mg/l iba(吲哚-3-丁酸，生长素的一种)、1mg/l 6-ba(6-苄氨基嘌呤，细胞分裂素)、1mg/l kt(激动素，细胞分裂素)、1mg/l ga(赤霉素，植物激素))处理下，发现在固体培养基中加入1mg/l的iba时，毛状根长势较好且诱导率较高，为80％。进一步在共培养阶段和除菌继代阶段，在固体培养基中都加入1mg/l的iba时，结果发现雷公藤毛状根诱导率为100％，仅在除菌继代第10天，所有叶片都诱导出了毛状根，该方法诱导率高且诱导速度快。