一种调节肠道微生物群以改善因轻度限时后重饲高脂饮食造成的生理影响的方法及其应用与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种调节肠道微生物群以改善因轻度限时后重饲高脂饮食造成的生理影响的方法及其应用。

背景技术：

1、超重和肥胖影响着全世界近20亿成年人，其中一半以上的人是肥胖者。通过限制随意食物摄入量的饮食策略，人们可以减轻体重，增强健康。众所周知，肠道微生物群和健康受到食物数量(管理食物摄入量)的关键影响，并被认为是连接饮食和宿主生理学的关键媒介。由于食物限制和再进食的影响，宿主的进食深度被打乱，肠道微生物群的组成也发生了变化，微生物群的振荡及其相关负面影响是否能改善成为一个有趣的问题。此外，治疗肥胖者的一个重要问题是减肥后的体重反弹以及肠道微生物群如何改变。

2、食物限制结束后的体重补偿性增长将使人们更加注意饮食和饮食限制。减肥后的体重反弹可能在疾病发展中起到关键作用。饮食方案中的食物限制-复食程度，以及食物供应时的肠道-饮食互动，可能对人们产生多方面的影响。一致的是，在许多研究中都注意到小鼠的类似行为。最近的一项研究表明，小鼠在限食之后的体重增加与更有效的代谢表型之间存在联系，该表型涉及用于能量采集的独特的肠道微生物群结构。然而，食物限制和再进食深度对宿主代谢概况、肠道微生物群和炎症的影响还不是很清楚。

3、首先为了确定改变食物限制深度和再进食对宿主生理学和肠道微生物群有效性的影响，本发明对12周龄成年和6周龄年轻小鼠实施了相同的两种限食方案，并检查了它们的代谢表型、肠道微生物群及相关性分析，探究这两种深度的限食-重饲对不同年龄宿主的长期影响。本发明背景研究中发现，小鼠在不同水平上进行食物限制处理，即限制自由摄入食物重量的15％和40％，然后再喂食高脂肪饮食。研究发现，轻度限食-重饲小鼠经历了显著不同的生理变化，包括脂肪堆积、肝脏炎症、肠炎和能量摄入的变化。此外，轻度限食-重饲小鼠的肠道微生物群与重度限食-重饲和两种对照组的肠道微生物群在很长一段时间内保持明显的不同。本发明描述了限食后重饲的小鼠肠道微生物群和代谢表型的变化，推断出轻度的饮食限制结束后重进食高脂饮食导致不同年龄段的小鼠出现较明显的异常脂肪积累、肝脏损伤、肠道炎症因子和免疫细胞募集增加，并涉及肠道微生物群的多种类型改变。本发明描述了一种调节肠道微生物群以改善因轻度限时后重饲高脂饮食造成的生理影响的方法，其特征在于显著改变肠道微生物种群lachnospiraceae、bacteroides和alistipes的水平。

4、目前，目前尚未有研究及临床关注轻度的饮食限制结束后重进食高脂饮食会导致不同年龄段的宿主出现较明显的异常脂肪积累、肝脏损伤、肠道炎症因子和免疫细胞募集增加、肠道微生物群变化等长期负面影响，以及该负面影响是否具备可塑性及其改善方法，缺乏一种调节肠道微生物群以改善因轻度限时后重饲高脂饮食造成的生理影响的方法及其应用。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术中的不足之处，本发明的目的是通过16s rrna测序，对比肠道微生物群的变化及组成，确定轻度限食后重饲高脂饮食造成宿主各方面负面影响及具体菌群的变化，并提供一种调节肠道微生物群以改善因轻度限时后重饲高脂饮食造成的生理影响的方法及其应用。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：本发明的第一方面是提供一种调节肠道微生物群以改善因轻度限时后重饲高脂饮食造成的生理影响的方法。本发明的第二方面是提供一种所述方法在评估肠道微生物群对宿主脂质代谢和炎症反应影响中的应用。本发明的第三方面是提供一种用于实施所述方法的装置，其特征在于包括用于灌胃的设备和用于分子生物学检测的设备。本发明的第四方面是提供一种用于制备用于所述方法的粪便样本的试剂盒。

3、本发明的一种调节肠道微生物群以改善因轻度限时后重饲高脂饮食造成的生理影响的方法，包括以下步骤：

4、s1分别将不同程度限食及重饲小鼠分组，分为普通对照组、高脂对照组、轻度限食组、重度限食组、轻度限食-重饲组、重度限食重饲组，收集粪便样本；

5、s2将不同组别粪便样本送测16s rrna，确定不同组别肠道微生物群的组成及具体菌群的变化；

6、s3将供体和受体小鼠分别进行分组，分为成年对照组、幼年对照组、成年限食重饲组和幼年限食重饲组；

7、s4在成年限食重饲组和幼年限食重饲组中实施轻度限食后重饲高脂饮食的处理；

8、s5收集成年对照组和幼年对照组动物的新鲜粪便样本；

9、s6将粪便样本通过匀浆、稀释、离心和过滤处理后，以灌胃方式传递至实验组动物体内；

10、s7在成年限食重饲组和幼年限食重饲组中实施轻度限食后重饲高脂饮食的处理。

11、进一步地，在步骤s2中，为了排除混杂的时间因素，在食物限制的第2周和转为自由采食后的第6周收集了各组粪便样本，比较了相同时间点的肠道微生物群。通过16s rrna基因的v3-v4区测序来研究。

12、进一步地，在步骤s1、s4中，轻度限食是通过限制小鼠自由摄入食物重量的15％，持续14天，之后重新高脂自由取食40天。

13、进一步地，在步骤s1、s5中，粪便样本的收集方法是将每组供体小鼠的新鲜粪便集中起来，匀浆后用无菌生理盐水稀释至最终浓度为1mg粪便/10μl，3000rpm转速下离心5分钟，通过70μm过滤器收集上清液。

14、更进一步地，在步骤s6中，粪便样本通过灌胃方式传递至实验组动物体内，灌胃量为10ml/kg。

15、进一步地，在步骤s7中，分子生物学技术包括定量聚合酶链反应qpcr、免疫荧光和酶联免疫吸附试验elisa。

16、本发明的方法在评估肠道微生物群对宿主脂质代谢和炎症反应影响中的应用。

17、本发明的一种用于实施所述方法的装置，其特征在于包括用于灌胃的设备和用于分子生物学检测的设备。

18、本发明的一种用于制备用于所述方法的粪便样本的试剂盒，包括无菌生理盐水和70μm过滤器。

19、进一步地，本发明描述了一种调节肠道微生物群以改善因轻度限时后重饲高脂饮食造成的生理影响的方法，其特征在于显著改变肠道微生物种群lachnospiraceae、bacteroides和alistipes的水平。

20、有益效果：本发明的包括改善肠道表型、减轻病理损伤、加强肠道屏障功能、降低促炎症因子表达、缓解肝脏炎症状态、调节lps水平，为临床提供精确的肥胖预防和治疗策略。

21、与现有技术相比，本发明具有如下优点：

22、(1)发现菌群的改变：通过16s rrna测序技术，本发明确定了不同程度限食-重饲小鼠的肠道微生物群组成发生变化。其中，轻度限食-重饲小鼠肠道微生物群结构发生了巨大变化，分离的肠道微生物群总量也与其他组明显不同。进一步分析发现该组小鼠的肠道微生物lachnospiraceae、bacteroides和alistipes的水平显著改变，lachnospiraceae和bacteroides水平更高，alistipes也显示出表达量增加。

23、(2)肠道表型的改善：通过粪便移植技术，本发明成功实现了对不同年龄段轻度限食-重饲受体小鼠的肠道表型进行改善。具体表现为两组年龄的受体小鼠小肠长度的增加，与供体小鼠相比，显示出对照组粪便的回补能够在结构上恢复部分肠道功能。

24、(3)病理损伤的减轻：粪便移植方法显著降低了轻度限食-重饲受体小鼠的肠道病理损伤评分。与供体小鼠相比，受体小鼠的肠道损伤程度有所减轻，表明粪便移植有助于修复肠道组织。

25、(4)肠道屏障功能的加强：免疫荧光同源双标实验显示，受体小鼠的肠道通透性得到改善，zo-1和occludin两种关键的紧密连接蛋白表达水平明显增多，这表明肠道屏障功能得到加强。

26、(5)促炎症因子表达的降低：通过qpcr实验，发现受体小鼠中促炎细胞因子tnf-α、il-1β和il-6的mrna表达水平显著降低，这表明粪便移植有助于减轻肠道炎症反应。

27、(6)肝脏炎症状态的缓解：尽管肝脏促炎因子的改善效果不显著，粪便移植方法对轻度限食-重饲小鼠的肝脏炎症状态有所缓解，提示肝脏损伤可能具有一定的可逆性。

28、(7)lps水平的调节：elisa实验揭示了粪便移植方法能够降低受体小鼠血清和肝脏中的lps含量，这与肝脏中ppar-α的表达呈负相关，表明肠道微生物群的调节可能通过lps-ppar-α途径影响宿主的脂质代谢和炎症反应。

29、(8)临床应用的潜力：本发明为临床提供了新的视角和方法，特别是在制定针对不同年龄段人群的肥胖预防和治疗策略方面。通过调节肠道微生物群，可以为饮食限制和再进食对宿主生理学影响的管理提供新的治疗策略。