一种高效构建斑马鱼helt基因大片段缺失的方法和应用与流程

文档序号:39718942发布日期:2024-10-22 13:06阅读:46来源:国知局
一种高效构建斑马鱼helt基因大片段缺失的方法和应用与流程

本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种高效构建斑马鱼helt基因大片段缺失的方法和应用,特别是利用crispr系统在斑马鱼helt基因簇中进行基因组大片段删除且首次删除bhlh-sf蛋白结构,高效构建用于研究由基因组大片段缺失导致阿尔兹海默症疾病动物模型。


背景技术:

1、母源因子的功能紊乱是导致不育和先天性畸形的重要原因之一。对母源因子功能的深入分析有助于揭示这些出生缺陷的成因,并据此制定有效的应对策略。在斑马鱼中,存在大量基因具有显著的母源输入,这些基因在胚胎发育过程中起着至关重要的作用。然而,传统遗传学方法在研究母源基因功能时面临诸多挑战,主要包括母源突变体产生耗时过长和纯合致死或不育表型导致难以获得突变体后代等问题。

2、crispr/cas9系统作为一种强大的基因编辑工具,已经在多种生物体中得到了广泛应用。然而,在斑马鱼早期胚胎中直接注射cas9rnp进行基因编辑时,产生的突变类型多以小的插入缺失(indel)为主,难以获得大片段的基因删除。这在一定程度上限制了其在研究复杂基因功能方面的应用。

3、传统遗传学方法获取母源突变体通常需要多个世代的反复筛选,耗时长达数月甚至数年。在斑马鱼早期胚胎中直接注射cas9rnp产生的突变类型单一,以大片段删除为主的突变类型难以获得。

4、基于此,本发明旨在提供一种高效构建斑马鱼helt基因大片段缺失的方法和应用。


技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高效构建斑马鱼helt基因大片段缺失的方法和应用,为解决现有技术中基因组大片段删除效率低的问题,本发明的主要目的在于提供高效构建helt基因组大片段删除突变体的方法且首次删除bhlh-sf蛋白结构,特别是通过crispr系统在斑马鱼helt基因中进行基因组大片段删除,大大提高基因组大片段删除效率。本发明的另一目的在于首次提供上述高效构建helt基因组大片段删除突变体缺失且首次删除bhlh-sf蛋白结构所导致的阿尔兹海默症疾病动物模型中的应用。

2、本发明还提供所述一种高效构建斑马鱼helt基因大片段缺失的方法在构建用于由基因组大片段缺失导致的阿尔兹海默症疾病治疗和药物筛选的动物模型中的应用。

3、进一步地,所述基因组大片段为bhlh-sf蛋白结构。

4、本发明还提供所述一种高效构建斑马鱼helt基因大片段缺失的方法在脊椎动物的基因组内基因大片段删除中的应用。

5、本发明提供的一种高效构建斑马鱼helt基因大片段缺失的方法,包括以下步骤:

6、s1、在设计待删除基因片段两端分别设计不少于2个特异性靶点;以grna骨架质粒为模板,进行pcr扩增得到pcr产物;纯化、转录后获得若干grna;随后将获得的grna与cas9蛋白分别显微注射导入到所述处理对象的一细胞期受精卵中;

7、s2、挑选所述处理对象胚胎期的卵提取基因组,分别用敲除靶点检测引物进行pcr扩增,得到pcr产物;将得到的pcr产物sanger测序;从待删除基因片段两端的特异性crispr靶点组成若干组最优靶点组合和分开单独组合;选取最优靶点组合分别进行显微注射导入到所述处理对象的一细胞期受精卵中;挑选所述处理对象胚胎期的卵提取基因组,经过双外侧引物pcr扩增,进行稳定培养,得到斑马鱼helt基因大片段缺失的突变体。

8、进一步地,所述靶点序列如下表所示:

9、 靶点名称 序列5-3 靶位点1 tgagaagagctgaccggagg 靶位点2 gactgagaagagctgaccgg 靶位点3 agtctgaagcgtctggaaag 靶位点4 acgcgcacactcgatgctct 靶位点5 catcgctgggtaggcgagcg 靶位点6 ccgctgtgctgagacatcgc 靶位点7 tgtgtaagctgaaggcattg

10、进一步地,所述扩增引物的序列如下表所示:

11、 特异性引物 序列 正向引物(f) gtggaacagaaagggacg 反向引物(r) gtgtatgctgcaaatgaaat

12、进一步地,所述grna的终浓度为120-160ng/μl,cas9蛋白的终浓度为400ng/μl,注射量为1nl。

13、进一步地,所述一种高效构建斑马鱼helt基因大片段缺失的方法同时满足:

14、所述处理对象的基因组大片段删除效率与其单个特异性crispr靶点的诱变效率呈正相关;与同时显微注射不少于两个特异性crispr靶点相比显微注射具有高诱变效率的最优靶点组合的基因组大片段删除效率高。

15、进一步地,通过上述一种高效构建斑马鱼helt基因大片段缺失的方法在斑马鱼helt基因簇中进行基因组大片段删除,包括以下步骤:

16、(1)在斑马鱼的helt基因簇中确定基因敲除的靶点序列,在符合crispr pam区的条件下,待删除基因片段两端分别设计不少于3个特异性crispr。

17、grna靶点序列;

18、(2)根据步骤(1)设计的特异性crispr grna靶点序列分别设计扩增引物;

19、(3)以grna骨架质粒为模板,采用引物t7-grnatarget作为正向引物和grna反向引物进行pcr扩增,得到pcr产物;

20、(4)步骤(3)得到的pcr产物进行纯化,体外转录,获得grna;

21、(5)步骤(4)得到的grna与cas9蛋白显微注射导入到斑马鱼的一细胞期受精卵中;

22、(6)挑选步骤(5)中斑马鱼48h胚胎期的鱼卵提取基因组,用敲除靶点检测引物进行pcr扩增,得到pcr产物;

23、(7)步骤(6)得到的pcr产物依次进行琼脂糖凝胶电泳,测序分析敲除情况;

24、(8)从待删除基因片段两端的特异性crispr靶点中选取1组特异性crispr靶点组成最优靶点组合;

25、(9)步骤(8)中得到的最优靶点组合分别显微注射导入到斑马鱼的一细胞期受精卵中;

26、(10)挑选步骤(9)中斑马鱼48h胚胎期的鱼卵提取基因组,依次经过双外侧引物pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳,稳定培养得到得斑马鱼基因组大片段删除的阿尔兹海默症突变体。

27、与现有技术相比,本发明的有益效果在于:

28、1、本发明首创性地识别并筛选出具备卓越突变能力的helt-grna,并开创性地移除了bhlh-sf蛋白结构。随后,我们精心挑选出高效的grna组合,通过显微注射技术精准地导入至一细胞阶段的斑马鱼受精卵中,利用crispr技术实现了高效的基因组大片段编辑。这一过程确保了大片段删除的效率与单个crispr靶点的特异性诱变能力直接正相关;且相比其他基因组编辑方法,采用最优靶点组合的显微注射策略展现了更高的诱变效率及大片段删除效能。

29、2、本发明聚焦于斑马鱼基因组的多位点精准编辑,通过精心设计针对特定靶点的grna,我们成功地将一对靶向特定基因的grna与cas9蛋白联合注入到一细胞期的胚胎细胞中。利用crispr/cas9系统的强大功能,我们在斑马鱼的helt基因簇内实现了长达1.4kb的基因组大片段删除,平均编辑效率超过50%,显著提升了此类编辑的效率和可行性。

30、3、本发明的技术不仅在斑马鱼的helt基因簇上实现了高效的基因片段删除,还首次通过删除bhlh-sf蛋白结构构建了阿尔茨海默病模型。这些携带基因组大片段删除的斑马鱼突变体,作为宝贵的动物模型,可用于深入探究基因组大片段缺失相关疾病的病理机制。尤为重要的是,本发明首次在斑马鱼体系中成功获得bhlh-sf蛋白缺失突变体,这些突变体展现出阿尔茨海默病样症状,包括生长迟缓、脑部及尾部发育异常等,为鱼类乃至更广泛生物体的生长发育研究开辟了新的视角和实验平台。

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