基于花青素形态标记鉴定番茄单倍体诱导系诱导效率以及筛选单倍体的方法

本发明属于作物育种单倍体制备，具体涉及一种基于花青素形态标记鉴定番茄单倍体诱导系诱导效率以及筛选单倍体的方法，该鉴定方法用花青素合成相关基因鉴定单倍体诱导系效率，该筛选单倍体的方法利用花青素合成相关基因来简单的筛选/鉴定单倍体，是一套有效鉴别系统。

背景技术：

1、单倍体育种技术可快速获得纯系并极大缩短育种进程。利用基因编辑技术敲除单倍体关键诱导基因dmp创制单倍体诱导系，突破了番茄单倍体诱导的技术难关。目前主要采用荧光法(zhong et al,2021)和甜菜红素(ruby)法(wang et al,2023)进行单倍体鉴定，但该技术目前还存在两大问题：1.荧光法单倍体鉴定效率不高，荧光需要借助设备，鉴定费时费力。2.甜菜红素对单倍体诱导系营养和生殖生长具有较强负向效应，影响单倍体的有效效率。因此，急需要一种新型高效的单倍体鉴定系统。

2、基于此，特提出本发明。

3、参考文献：

4、zhong,y.,chen,b.,wang,d.,zhu,x.,li,m.,zhang,j.,chen,m.et al.(2022)invivo maternal haploid induction in tomato.plantbiotechnol.j.20,250-252.

5、wang,d.,zhong,y.,feng,b.,et al.(2023)the ruby reporter enablesefficient haploid identification in maize and tomato.plant biotechnol.j.7-9.

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明目的之一在于提供一种基于花青素形态标记筛选单倍体的方法，该方法简单、高效、准确率高，而且花青素过表达后对单倍体诱导系营养和生殖生长基本没有负向效应，不影响单倍体的诱导效率。

2、本发明的另一目的在于提供一种基于花青素形态标记鉴定番茄单倍体诱导系诱导效率的方法。

3、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、本发明第一方面提供了一种基于花青素形态标记鉴定番茄单倍体诱导系诱导效率的方法，包括：将作为父本的待鉴定诱导效率的花青素正常表达的番茄单倍体诱导系分别与作为母本的番茄绿胚轴雄性不育系进行杂交，基于产生后代群体中的单倍体与母本胚轴颜色相同但与杂交种不同、以及母本无法自交可避免自交种干扰的原理，统计每个父本与母本杂交后形成的杂交后代群体中的绿胚轴个体(即单倍体)数量，由此计算得到单倍体诱导效率。

5、本发明第一方面提供的方法利用了作为母本的番茄绿胚轴雄性不育系的胚轴或茎秆颜色表型为绿色的特点，简单容易地将杂交二倍体与单倍体区分开，单倍体的胚轴或茎秆颜色应该与母本颜色相同，也为绿色。基于此可以计算出单倍体诱导率，即单倍体诱导率＝单倍体数量/杂交后代总数。

6、在本发明第一方面提供的方法中，所述番茄绿胚轴雄性不育系的番茄茎秆或胚轴为绿色且雄性不育，其为育性基因和花青素合成相关基因发生纯合突变且相应编码蛋白功能缺失的番茄品系，育性基因可以为tm6、ms10、ms15，花青素合成相关基因可以为gstaa、f3h、dfr等。

7、番茄绿胚轴雄性不育系的获得可以采用不育系常规创制方法获得，其为二倍体，可选地，所述番茄绿胚轴雄性不育系是通过crispr-cas9基因编辑技术敲除育性基因和花青素合成相关基因来获得。

8、本发明具体实施方式中使用的番茄绿胚轴雄性不育系可以是参照文献liu,j.w.,wang,s.f.,wang,h.,luo,b.,cai,y.y.,li,x.d.,zhang,y.f.,and wang,x.f.(2021).rapid generation of tomato male-sterile lines with a marker use for hybridseed production by crispr/cas9 system.mol.breed.41,25中的方法创制的不育系；也可以是参照专利cn202010787253.3创制的绿胚轴不育系；还可以是参照专利cn201910151374.6创制的绿胚轴不育系；也可以是参照专利cn202310889054.7创制的绿胚轴不育系。创制上述雄性不育系时使用的原始番茄品系可以是现有任何品系。

9、在本发明第一方面提供的方法中，所述待鉴定诱导效率的花青素正常表达的番茄单倍体诱导系为二倍体，其为单倍体关键诱导基因dmp发生纯合突变且相应编码蛋白功能缺失的番茄品系。

10、创制上述番茄单倍体诱导系时使用的原始番茄品系可以是现有任何品系。

11、在具体实施方式中，所述待鉴定诱导效率的花青素正常表达的番茄单倍体诱导系可以通过crispr-cas9基因编辑技术敲除dmp基因使其蛋白功能缺失来获得的，也可以通过突变其它基因或通过任何其它手段获得。通过基因编辑技术对不同品系的番茄进行dmp基因突变时可以获得不同遗传背景的纯合突变株，不同遗传背景的纯合突变株的单倍体诱导效率会有差异，通过其它基因突变或其它手段获得的单倍体诱导效率也会存在差异。因此，在进行单倍体制备前，需要筛选出诱导效率最高的番茄单倍体诱导系。

12、本发明第二方面提供一种基于花青素形态标记筛选单倍体的方法，所述方法包括：

13、步骤s1：将作为父本的待鉴定诱导效率的花青素正常表达的番茄单倍体诱导系分别与作为母本的番茄绿胚轴雄性不育系进行杂交，基于产生后代群体中的单倍体与母本胚轴颜色相同但与杂交种不同、以及母本无法自交可避免自交种干扰的原理统计每个父本与母本杂交后形成的杂交后代群体中的绿胚轴个体数量并计算单倍体诱导率，由此确定单倍体诱导率最高的花青素正常表达的番茄单倍体诱导系，以用于下一步花青素过表达的番茄单倍体诱导系(pchi,purple-color haploid inducer)的创制；

14、步骤s2：获取pchi；

15、步骤s3：以所述花青素过表达的单倍体诱导系为父本、以任选番茄二倍体品系作为母本进行杂交，然后根据后代群体中花青素表型筛选单倍体，花青素表型与母本花青素表型基本一致的个体初步确定为单倍体。

16、步骤s1和s3中的花青素正常表达的番茄单倍体诱导系和花青素过表达的单倍体诱导系均为纯合品系。

17、步骤s3中作为母本的任选番茄二倍体品系，可以是纯合品系也可以是f1杂交品种，番茄二倍体品系是正常表达花青素的。

18、本发明涉及的花青素正常表达是指番茄内花青素相关合成基因未发生突变而导致花青素表达量降低，番茄植株的表型为芽或苗期叶片(包括子叶)为绿色，根为白色，下胚轴为浅紫色。花青素过表达是指番茄内花青素表达量超出正常表达范围，花青素过表达时，番茄植株表型为芽或苗期叶片(包括子叶)为紫色，根为紫红色，下胚轴为深紫色。

19、本发明第二方面提供的方法利用了花青素在作为父本的单倍体诱导系中的过表达，通过杂交后代中花青素积累表型来鉴定是否为单倍体，可有效用于单倍体鉴定。而且花青素过表达的单倍体诱导系的营养生长和生殖生长均不受影响，对诱导效率也无显著影响，可加速番茄单倍体育种。

20、在本发明第二方面提供的方法中，步骤s1中提到的待鉴定诱导效率的花青素正常表达的番茄单倍体诱导系、番茄绿胚轴雄性不育系同本发明第一方面提到的相关内容，此处不再赘述。

21、在本发明第二方面提供的方法中，作为一种可选方式，所述番茄绿胚轴雄性不育系为育性基因和花青素合成相关基因同时发生纯合突变且相应编码蛋白功能缺失的番茄品系。优选地，所述番茄绿胚轴雄性不育系是通过crispr-cas9基因编辑技术敲除育性基因和花青素合成相关基因来获得。

22、在本发明第二方面提供的方法中，作为一种可选方式，所述待鉴定诱导效率的花青素正常表达的作为父本的番茄单倍体诱导系，优选地，为dmp基因发生纯合突变且相应编码蛋白功能缺失的番茄品系。优选地为所述待鉴定诱导效率的花青素正常表达的番茄单倍体诱导系是通过crispr-cas9基因编辑技术敲除dmp基因来获得的。

23、在本发明第二方面提供的方法中，作为一种可选方式，所述获取pchi的方法包括：通过向花青素正常表达的番茄单倍体诱导系中导入花青素相关合成基因，以促使番茄过表达花青素，比如导入花青素合成的主效调控因子slan2-like。具体地，将番茄中花青素合成的主效调控因子slan2-like导入花青素正常表达的番茄单倍体诱导系，然后通过筛选获得pchi。或者pchi采用如下方法获得：将slan2-like导入野生型番茄品系中，经筛选获得花青素过表达转基因植株slant2-like-oe，然后将该转基因植株与所述野生型番茄品系dmp突变形成的dmp单倍体诱导系杂交，杂交后代再经自交分离获得了花青素过表达的单倍体诱导系。

24、可选地，编码主效调控因子slan2-like的核酸序列可以通过重组载体导入花青素正常表达的番茄单倍体诱导系。

25、本发明第三方面还提供了pchi在培育番茄单倍体中的应用。

26、在本发明第三方面的具体实施方式中，所述应用具体为：以pchi为父本、以任选番茄二倍体品系作为母本进行杂交，然后根据杂交后代中花青素表型筛选单倍体，花青素表型与母本花青素表型基本一致的杂交后代初步确定为单倍体。

27、在本发明第三方面的应用中，pchi可以按照如下方法获得：首先通过crispr-cas9基因编辑技术敲除dmp基因并导致该基因编码蛋白功能缺失，然后向获得的纯合突变体中导入控制花青素表达的相关基因，比如主效调控因子slan2-like，经过常规筛选确定能过表达花青素的转基因植株作为pchi。常规筛选包括pcr鉴定控制花青素表达的相关基因是否正常导入突变体中，以及western-blot鉴定该基因是否过表达。

28、或者pchi采用如下方法获得：将slan2-like导入野生型番茄品系中，经筛选获得花青素过表达转基因植株slant2-like-oe。将该转基因植株与所述野生型番茄品系dmp突变形成的dmp单倍体诱导系杂交，杂交后代再经自交分离获得了花青素过表达的单倍体诱导系slan2dmp-oe纯合子，即pchi。

29、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

30、(1)该方法利用绿胚轴雄性不育纯合突变体与待鉴定诱导效率的单倍体诱导系(比如dmp突变体)进行杂交，杂交后代获得的绿胚轴株均为单倍体，因此，通过统计杂交后代中的绿胚轴株数量来计算单倍体诱导系的诱导效率，方法简单、快速高效，统计结果可靠。

31、(2)本发明通过敲除dmp基因并过表达花青素调控基因获得花青素过表达单倍体诱导系，用花青素过表达单倍体诱导系进行授粉，在后代群体中可以通过花青素积累表型差异鉴定单倍体，因此可有效用于单倍体鉴定。

32、(3)本发明还提供了由采用(1)中方法统计的诱导效率确定诱导效率最高的单倍体诱导系，然后向该诱导系中导入花青素调控基因使其过表达花青素，由此获得诱导效率最高的花青素过表达单倍体诱导系，基于该诱导系培养单倍体可快速有效筛选单倍体，且对诱导效率无显著影响，可加速番茄单倍体育种。