一种秋水仙素诱导蒲公英染色体加倍的方法

本发明涉及植物多倍体育种，具体地，涉及一种秋水仙素诱导蒲公英染色体加倍的方法。

背景技术：

1、碱地蒲公英是菊科蒲公英属植物，是传统的药食同源多年生植物，常用的清热解毒中药植物，在中医中有“天然抗生素”和“草药皇后”之称，不仅全草可入药，而且也可以作为食品、保健食品、牲畜饲料等的来源，每年用量巨大。碱地蒲公英资源较为丰富，但由于长期进行无性繁殖，无法杂交育种，碱地蒲公英的遗传学和生物学多样性不能够得到充分利用，同时一些优良种质也因种性退化而濒临灭绝，经报道审定的丰产型蒲公英品种仅有4个，包括山西农业大学赵晓明教授于药蒲公英野生群体中经多年系统选育而成的多倍体新品种“铭贤1号”；杨国正从野生蒲公英资源中采用系统驯化、选育的方法，选育出一个性状基本稳定、丰产性良好（产量是驯化前的3倍以上）、抗逆性较强的新材料，暂命名“华蒲1号”；河北省农林科学院滨海农业研究所采用耐盐突变体与耐盐鉴定相结合的方法选育的耐盐型高产蒲公英品种“滨蒲1号”和“滨蒲3号”。因此蒲公英的种质资源创新和新品种培育势在必行。

2、多倍体植株由于染色体加倍，产生叠加效果，具有相对的“巨大化”、植物生物量及次级代谢产物量高、适应性和抗逆性强等特点。因此，多倍体育种可以提高作物产量、改善作物产品品质、增强作物的抗逆性，是作物品种改良的重要途径，多倍体育种还可提高中药材植株的药用价值和商业价值，为新种质创制和优异新品种培育提供了可能。

3、杨玉双等公开了“氨磺灵和秋水仙素诱导橡胶草四倍体效果的比较研究”（中国农学通报 2021,37(20):35-41），初步探明了氨磺灵和秋水仙素2种诱变剂对橡胶草染色体加倍的诱导效果，结果表明，氨磺灵比秋水仙素更适合用于橡胶草多倍体诱导。其中氨磺灵处理橡胶草的成苗率为60%~75%、最高诱变率为14.08%，均高于秋水仙素处理的成苗率0~59%和最高诱变率5.56%，其嵌合体率为27.27%，低于秋水仙素处理75.00%，其中0.04mmol/l氨磺灵处理30min，成苗率为71.00%，变异率14.08%，为最佳诱变条件。

4、钟淑梅发表的硕士学位论文“蒲公英人工加倍及其应用价值研究”（2010年，华中农大植物科学技术学院），采用蒲公英叶片作为外植体，接种到添加不同秋水仙素浓度的诱导培养基中培养，结果表明，浓度为75mg/l的诱导培养基诱导率最高，达到13.73%。但其存在的主要缺点如下：1）蒲公英愈伤组织诱导存在难以得到纯合植株的问题，愈伤组织作为胚性细胞堆积在一起，不能保证所有细胞都得到了加倍，诱导加倍后分离成纯合单株困难；2）诱导体系构建耗费时间长，易污染，成功率低；诱导体系从外植体接种到愈伤组织、成芽再到生根、炼苗、移栽、鉴定诱变植株，需要5~6个月，技术繁琐；3）再生植株试管苗种植于田间，需较大的人力物力，在生长过程中纤细脆弱，移栽成活率低，致使蒲公英品种改良技术受到限制，难以应用到实践。

技术实现思路

1、本发明提出一种秋水仙素诱导蒲公英染色体加倍的方法，解决了相关技术中碱地蒲公英传统育种困难、新型育种技术匮乏、优良品种少、一些优质品种生物量小、影响碱地蒲公英产业发展的问题。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明提出一种秋水仙素诱导蒲公英染色体加倍的方法，包括以下步骤：播种，萌发后，得到幼苗，将秋水仙素溶液涂于所述幼苗的植株生长点进行诱导处理，得到染色体加倍的蒲公英。

4、作为进一步的技术方案，所述幼苗的时期包括两片子叶时期、两叶一心时期中的一种或两种。

5、作为进一步的技术方案，所述幼苗的时期为两片子叶时期。

6、作为进一步的技术方案，所述秋水仙素溶液的质量浓度为0.05%~0.15%。

7、作为进一步的技术方案，所述秋水仙素溶液的质量浓度为0.05%~0.12%。

8、作为进一步的技术方案，所述秋水仙素溶液的质量浓度为0.10%。

9、本发明采用浓度为0.10(w/v)%秋水仙素溶液、处理时期为两片子叶时期时，蒲公英幼苗的成活率为47.82%，四倍体率高达38.66%，该方法既保证了较高的四倍体诱导率，又兼顾了较高的幼苗成活率，为碱地蒲公英多倍体育种提供依据，对碱地蒲公英新种质创制和多倍体育种具有重要意义。

10、作为进一步的技术方案，所述播种的方式为穴播方式。

11、作为进一步的技术方案，诱导处理后进行初筛，得到二倍体和四倍体嵌合植株和纯四倍体植株，将所述二倍体和四倍体嵌合体植株进行纯化，所述纯化包括以下步骤：将所述二倍体和四倍体嵌合体植株继续种植，直至得到二倍体和四倍体嵌合体种子，将所述二倍体和四倍体嵌合体种子进行播种，表型分离后，进行染色体倍性测试，测定为四倍体时，进行种植，得到纯四倍体植株。

12、本发明中筛选具体为：加倍后的新叶会出现三种情况，一种为未加倍的二倍体材料，一种为二倍体和四倍体的嵌合体的材料，另一种为纯四倍体材料；培养30天后，从植株中初步筛选具有叶片加厚、肉质化，叶面积减小，叶数多，侧根减少等特点的幼苗，用流式细胞仪进行染色体倍性的测定，测定过程以未加倍的材料的新叶作为对照，对不同倍性植株进行初筛并标记，以便后续倍性确定。

13、作为进一步的技术方案，所述植株生长点为长出真叶的位置。

14、作为进一步的技术方案，所述播种时采用碱地蒲公英种子，所述碱地蒲公英种子为二倍体碱地蒲公英种子。

15、本发明还提出一种秋水仙素诱导蒲公英染色体加倍的方法在诱导蒲公英染色体加倍中的应用。

16、本发明的工作原理及有益效果为：

17、1、本发明中，采用秋水仙素处理溶液处理优质碱地蒲公英幼苗，使其产生多倍体，以培育高产优质耐盐的碱地蒲公英，实现品种改良，促进碱地蒲公英产业的发展，以适应盐碱地种植。此外，本发明提供的秋水仙素诱导蒲公英染色体加倍的方法从种子育苗到诱导处理、诱变植株、鉴定，需要3个月即可，相比于现有技术时间缩短了一半，操作简单，提高了育种效率。

18、2、本发明中，将蒲公英种子直接播种于大田，以秋水仙素作为诱导剂，诱导碱地蒲公英幼苗染色体加倍，获得四倍体植株，以植株幼苗生长点作为诱导部位，操作简单，可行性高，易于管理，能明显提高幼苗成活率。该方法克服了传统方法中以叶片等为外植体诱导加倍时的污染等问题，避免了传统愈伤组织途径诱导试管苗出芽、生根、炼苗、移栽等繁琐过程，节省培育时间，降低人工及生产成本，提高了育种效率，保证了诱导四倍体植株大田种植的可行性。该方法操作容易，诱导稳定，是一种适合碱地蒲公英多倍体诱导的方法。

19、3、本发明中，利用秋水仙素直接诱导碱地蒲公英植株幼苗生长点，诱导率高（诱导率最高38.66%，高于愈伤组织诱导13.73%）、加倍育种时间节省50%，操作简单，可行性高，降低生产成本。

20、4、碱地蒲公英与橡胶草均属蒲公英属，但不是一个种，基因和生物学特性不同：橡胶草根部橡胶含量高，为三大产胶植物之一，相比于碱地蒲公英野生种，个体小，长势弱；本发明采用碱地蒲公英为药用植物，全草入药，主要利用部位茎叶含有菊苣酸、咖啡酸等酚酸成分，耐盐碱性好，相较于橡胶草生物量大。此外，本发明采用的加倍部位为种子萌发后的幼芽诱导，由于橡胶草种子本身萌发比较困难，萌发率低，氨磺灵适合橡胶草多倍体诱导，诱变率为14.08%，而秋水仙素加倍的方法变异率低，仅有5.56%；发明人经过大量试验验证，采用碱地蒲公英种子萌发后的幼芽进行秋水仙素加倍处理，成活率极低，几乎为零，因此，该技术在碱地蒲公英加倍方面可复制的可能性小，不适合诱变处理。

21、5、本发明是直接以土壤中生长到两片子叶期的幼苗为试验材料，相比于传统的以碱地蒲公英愈伤组织为材料或以培养皿中种子萌发后的胚芽为材料浸泡后再移栽成苗，省去种子萌发移栽以及愈伤组织成苗的步骤，工艺更简单且成活率更高。