一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种间充质干细胞的冻存液及冻存方法。
【背景技术】
[0002] 干细胞（stem cell)是一类具有自我复制能力（self-renewing)的多潜能细胞。 在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells， MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有干细胞的共 性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神 经、心脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希望的来源 细胞之一，是近几年研宄的热点。MSC作为重要的再生医学资源，在临床的疾病治疗领域将 有非常重要的应用价值。
[0003] 间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冻存复苏后仍具有多向分化潜能，可作 为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，研宄一种有效的细胞 冻存方法，使具有临床应用价值的MSC能在体外长期保存并维持原有的多向分化能力，显 得尤为重要。
[0004] MSC的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，用含有特定成分的细胞冻存 液制成单细胞悬液，分装于冻存管中后置于超低温冰箱或者液氮中进行长期冻存。
[0005] 目前现有技术中，细胞冻存液中的主要成分有10%二甲基亚砜（DMS0)、20%~ 90%胎牛血清（FBS)、剩余组分为不完全培养基。培养基以及FBS可为细胞提供必要的营 养物质。DMSO是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，从而达到降低细 胞损伤的保护效果。但FBS属于动物源性物质，成分比较复杂，在临床应用上存在潜在的风 险，也增加了污染的几率。而高浓度DMSO在常温状态下对细胞具有非常大的毒性作用。
[0006] 细胞冻存的方法在现有技术中采用最多的是利用冻存盒置于超低温冰箱中放置 24~72h，再转移至液氮中进行长期的保存。但冻存盒在逐渐降温的过程中无法精确控制 降温速率，会导致冻存液中形成较多的冰晶，导致细胞受到较大的损伤。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种间充质干细胞的 冻存液及冻存方法。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] -种间充质干细胞的冻存液包括无血清培养基、DMSO、右旋糖酐-40,其中所述 DMSO的浓度为3v/v%~7v/v%，按g/mL计右旋糖酐-40的浓度为lw/v%~3w/v%。
[0010] 本发明所述间充质干细胞的冻存液中含有非渗透性抗冻剂右旋糖酐40,降低了 DMSO的浓度。右旋糖酐40能溶于水，但不能进入细胞，使溶液呈过冷状态，通过降低溶质损 伤从而起到保护作用。
[0011] 在一些实施方案中，所述的冻存液中所述DMSO的浓度为5v/v%，按g/mL计右旋糖 酐-40的浓度为lw/v%。
[0012] 在一些实施方案中，所述的冻存液中所述无血清培养基为IonzaUltra⑶LTURE MEDIUM无血清培养基。
[0013] 本发明还提供了一种间充质干细胞的冻存方法，取间充质干细胞细胞悬液离心收 集细胞，用本发明所述间充质干细胞的冻存液重悬细胞并调整细胞密度，分装于冻存管中 冻存。
[0014] 在一些实施方案中，所述的冻存方法中，所述细胞密度为IX 106/mL。
[0015] 在一些实施方案中，所述的冻存方法中，所述冻存的具体方法为< -80°C冻存。
[0016] 在一些优选实施方案中，所述的冻存方法中，所述< -80°C冻存为-80°C超低温冰 箱长期冻存或液氮中长期冻存。
[0017] 在另一些实施方案中，所述的冻存方法中，所述冻存的具体方法为程序降温仪逐 渐降温至-90 °C后转移至液氮中进行长期保存。程序降温仪能够更精确地控制降温速率，避 免冰晶的产生，降低细胞的损伤。
[0018] 在一些优选实施方案中，所述的冻存方法中，所述程序降温仪降温程序为：
[0019] 4°〇，维持51^11;
[0020] _1°C/min直至 _4°C;
[0021] -25°C/min直至-12°C ;
[0022] -1°C/min 直至-40°C ;
[0023] -10°C/min直至-90°C;
[0024] -9(TC，维持 5min。
[0025] 本发明所述间充质干细胞的冻存方法方法，适用于所有类型MSC的冻存方法，所 述间充质干细胞可以为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间 充质干细胞、牙髓间充质干细胞或外周血间充质干细胞。
[0026] 在一些实施方案中，所述间充质干细胞的分离培养方法具体为组织块剪碎，加入 完全培养基，于37°C，5% 0)2静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬出后去掉 组织块，清洗后加入完全培养基继续培养，当细胞融合度达到80 %~90 %后，去掉细胞培 养上清，清洗后加入含EDTA的胰蛋白酶消化液消化，完全培养基终止消化，细胞吹打成单 细胞悬液。
[0027] 其中，在一些实施方案中，所述间充质干细胞的分离培养方法中所述完全培养基 的组成成分为：Lonza通用UltraCULTURE无血清培养基+5v/v % PALL血清替代物+2mM/ L-谷氨酰胺 +100mg/L NEAA。
[0028] 在一些实施方案中，所述间充质干细胞的分离培养方法中所述含EDTA的胰蛋白 酶消化液中胰蛋白酶浓度为0. 25% (体积分数），EDTA浓度为0. 04% (体积分数）。
[0029] 在一些实施方案中，所述间充质干细胞的分离培养方法中所述原代分离培养方法 中消化液消化的时间为l_2min。
[0030] 在一些实施方案中，所述间充质干细胞的分离培养方法中所述间充质干细胞来源 与脐带组织。所述脐带可以取自产后弃置的脐带组织，采用含有双抗的PBS保存。所述含 有双抗的PBS为含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液，其中青霉素工作浓度为100U/mL，链霉 素工作浓度为0. lmg/mL。
[0031] 本发明所述间充质干细胞的分离培养方法中，在组