借助游离小孢子培养和ems诱变创制大白菜突变体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种在游离小孢子培养过程中与 EMS诱变相结合创制大白菜突变体的方法。
【背景技术】
[0002] 大白菜属于十字花科芸薹属A基因组植物，是我国种植面积最大的蔬菜作物。大 白菜的基因组序列已经于2011年释放，其分子生物学研宄进入了功能基因组阶段，大白菜 突变体是其功能基因组学研宄的重要材料。
[0003] 人工诱变可以产生丰富的突变体材料。人工诱变的方法有很多种，包括物理（如 辐射）诱变，化学诱变（如EMS诱变），T-DNA插入诱变和AC/DS转座诱变等。其中，EMS是 化学诱变中应用最广泛的诱变剂。与其他诱变剂相比，EMS诱变产生的点突变频率高，且多 为显性突变，染色体畸变相对较少。
[0004] 传统的诱变方法是利用诱变技术处理植株的种子，并在田间对诱变植株进行鉴 定和选择。种子是最早也是最常用来作为EMS诱变处理的材料，但通常EMS诱变种子效率 很低。游离小孢子培养可以为离体诱变提供新的途径，其在创制突变体方面具有明显的优 势，可以快速获得目标性状、缩短创制纯合突变体的时间、提高诱变效率。本发明将游离小 孢子培养和EMS诱变相结合，旨在快速创制纯合的大白菜突变体。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是创建一种快速创制大白菜突变体的新方法，将游离小孢子培养技 术和EMS诱变相结合，旨在快速获得纯合的大白菜突变体，提高构建突变体库的效率。
[0006] 本发明提供的借助游离小孢子培养和EMS诱变创制大白菜突变体的方法，主要步 骤包括：
[0007] (1)所用的诱变材料为双单倍体纯系（DH系），在开花期选取小孢子发育期为单核 晚期至二核早期的未开放花蕾，即长度为2-4mm，进行游离小孢子培养；
[0008] (2)在小孢子培养过程中，采用不同浓度0· 04%、0· 08%、0· 12% [v/v]EMS溶液对 小孢子进行诱变处理，处理时间均为l〇min，经过培养获得小孢子再生植株（Mtl);
[0009] (3)将Mtl代再生植株移栽到温室，利用流式细胞仪对其进行倍性鉴定，筛选出双单 倍体植株；
[0010] (4)在获得的双单倍体植株中，通过对叶色、叶形、花瓣颜色、花瓣形态、雄蕊育性 和株型等植物学性状鉴定，筛选出M tl变异植株；
[0011] (5)将所有的Mtl代双单倍体植株自交，获得M #种子；
[0012] (6)播种M1种子，进一步鉴定突变性状，筛选稳定遗传的突变体材料；
[0013] (7)经试验筛选，创制大白菜突变体的适宜EMS溶液浓度为0· 08% ;
[0014] 上述步骤（2)的具体内容：将长度为2-4mm的未开放花蕾在超净工作台上经浓度 为75%乙醇溶液表面消毒30s后，用浓度为0. 1 %氯化汞溶液消毒8min，再用无菌水冲洗3 次，每次5min。
[0015] 消毒后的花蕾放入灭过菌的小烧杯内，加入蔗糖浓度为130g · Γ1，PH值为5. 8的 Β5培养基，用无菌研棒碾压花蕾，使小孢子游离出来，用40 μπι孔径的尼龙网过滤含小孢 子的悬浮液，收集滤液于IOmL离心管中，1000 rpm离心3min，弃上清液，沉淀加 IOmL Β5培 养基，摇匀，1000 rpm离心3min，弃上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子。此时，分别加入浓 度为 〇(对照），0.04 %，0.08 %，0· 12% (v/v)的 EMS 溶液，摇匀，处理 IOmin 后，1000 rpm 离心3min，弃上清液，将诱变处理后的小孢子用NLN培养基稀释，稀释密度至1~2X IO5 个，以每皿5mL小孢子悬浮液分装入直径60_的无菌培养皿内，每皿添加100 μ L高 温灭菌后的0. 5g · Γ1琼脂糖和IOg · LH活性炭混合液；用石蜡膜封口，33°C恒温箱中暗培 养24小时，再转移至25°C培养箱暗培养10~15天，肉眼可见胚状体后，将培养皿转移到 转数为40~60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25°C ;将子叶期胚状体转接到MS 培养基上，在25°C，16h/8h光周期条件下培养；获得小孢子再生植株后，再进一步将再生植 株接种到MS培养基上进行生根培养。
[0016] EMS溶液设0.04 %，0.08 %，0. 12% (v/v) 3个浓度梯度，将EMS溶于蔗糖浓度为 130g · Γ1，PH值为5. 8的B5培养基中，抽滤备用，以未处理的小孢子作对照。
[0017] NLN培养基为含130g · Γ1蔗糖，添加激素0. 05mg · L 苄氨基腺嘌呤）和 0· 05mg · L-1NAA ( α -萘乙酸），PH值为5. 8的NLN培养基。
[0018] 诱导再生植株的MS培养基为含30g · Γ1蔗糖，6. 5~7. 5g ·厂1琼脂，pH值为 5. 8~6. 0,未添加任何激素的MS培养基；诱导再生植株生根的MS培养基为含30g · Γ1蔗 糖，5. 5g · Γ1琼脂，0· Img · L -1NAA ( α -萘乙酸），pH值为5. 8~6. 0的MS培养基。
[0019] 上述步骤（3)的具体内容：利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定，筛选出双 单倍体植株。首先，取直径为1~2cm大小的新鲜嫩叶放入培养皿内，加入1. 5~2. OmL Chopping Buffer缓冲液（15mmol · I71三轻甲基氨基甲烧，2mmol ·厂1乙二胺四乙酸二钠， 0. 5mmol · I71精胺，80mmol ·厂1氯化钾，20mmol ·厂1氯化钠，0. 1% [v/v]聚乙二醇辛基苯 基醚和15mmol · Γ1二巯基乙醇，pH 7. 5)，用手术剪刀将叶片剪碎，然后，吸取上清液，用 300目筛网将样品过滤到离心管内，1000 rpm离心10min，离心后弃上清，沉淀加 ImL PI (碘 化丙啶）染液，混匀避光染色15min，最后，将样品用500目筛网过滤到上样管中，混匀上机 检测，20s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图；以已知二倍体的野生型诱 变材料作为对照，使对照的DNA吸收峰处在200道（X轴）位置，每个待测植株分别测定3 次，DNA吸收峰值处在200道的样本即为二倍体，而峰值处在100和400道的分别为单倍 体和四倍体。
[0020] 上述步骤（7)的具体内容：在获得的稳定遗传的突变体材料中，其中绝大多数突 变体（83. 33% )均来自于浓度为0. 08%的EMS溶液处理，由此，经本试验筛选，创制大白菜 突变体的适宜EMS溶液浓度为0. 08 %。
[0021 ] 本发明的积极效果
[0022] (1)所用的诱变原始材料为小孢子双单倍体系（DH系），它是遗传意义上的纯系。 如果获得突变体，与野生型之间的遗传背景完全一致，只是在突变位点上存在差异，可以为 克隆突变基因提供了理想的试验材料。
[0023] (2)在小孢子培养过程中，对单倍体小孢子进行诱变处理，突变了的小孢子再生成 的双单倍体，即为纯合突变体，突变性状在当代就能表现，可以快速筛选出突变材料。
[0024] (3)以单倍体小孢子为诱变处理材料，便于扩大诱变处理的群体规模。游离小孢子 培养技术具有快速获得纯合育种材料的优点，将其与EMS诱变相结合，可以极大地提高诱 变效率，加快创制突变体的速度。
[0025] (4)本发明获得的大白菜纯合突变体，不仅可以为大白菜育种研宄提供新的种质 资源，还可为大白菜功能基因组学研宄提供优良的突变材料。
【附图说明】
[0026] 图1 :经EMS诱变后培养获得的小孢子胚状体。
[0027] 图 1 中：a:0 处理；b:0. 04%处理；c:0. 08%处理；d:0. 12%处理；
[0028] 图2 :经EMS诱变后小孢子胚状体的成苗情况。
[0029] 图2中：a:直接成苗；b:愈伤组织；c