细胞制备方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本发明专利申请按照35USC§ 111提交，要求2012年9月18日提交的美国临时专 利申请61/702, 335的优先权，其通过引用纳入本文。
技术领域
[0003] 本发明领域一般涉及制备冷冻保存肝细胞的新方法，具体涉及分离的肝脏实质细 胞（肝细胞）。
【背景技术】
[0004] 肝的实质细胞，一般称为肝细胞，是药物代谢有关的主要细胞类型，并且是可被肝 毒物损伤的细胞。因此，这些细胞代表了用于评价药物代谢和肝毒性所需的实验系统。有 多篇科学出版物关于肝细胞在药物研发中的此类应用。
[0005] 药物研发的主要问题在于，大量候选药物会因其无功效或具有负作用而在临床中 失败，即便选择用于临床试验的候选药物已经采用实验动物进行了广泛的临床前研宄并认 为具有可接受的功效和安全性也是如此。主要原因之一是物种差异，g卩，人类药物作用可能 不同于实验动物中发现的那样。
[0006] 主要物种差异之一是药物代谢。现已知人和非人动物在多种药物代谢酶通路中具 有差异，最重要的是P450单加氧酶中的差异。所述酶通路中的差异造成外源物质的代谢命 运差异。如果某一药物的毒性由仅在人类中形成的代谢所致，则该药物可能对人类具有毒 性，而对实验动物却并非如此。相反，如果某一药物的毒性代谢具有动物特异性但不在人类 中形成，则该药物可能对动物具有毒性而非人类。
[0007] 因此，分离自实验动物和人类的肝细胞代表了用于评价药物代谢和毒性的可能物 种差异的重要实验系统。肝细胞的应用通过成功冷冻保存而进一步具有实用性。冷冻保存 的肝细胞使科学人员能够利用肝细胞，简单地通过解冻并使用该细胞而进行研宄，避免了 耗时的分离操作。目前，来自动物和人类的冷冻保存的肝细胞可市售购得，以用于研宄。
[0008] 人类药物代谢的个体差异是已确立的现象。该差异可能由遗传和环境因素造成。
[0009] 来自一个个体的肝细胞可能与来自另一个体的肝细胞具有本质差异。为协助使个 体差异"标准化"，基于人类的药物代谢系统通常涉及来自不同个体的合并的材料。例如， 用于评价药物代谢的主要实验系统之一，人肝微粒体，通常由多个人类肝脏制备。该方法已 于近期延伸至人肝细胞。
[0010] 解冻、汇集和重新冷冻肝细胞的典型操作需要稀释冷冻保存培养基，然后离心通 过高密度介质，以富集活细胞，然后进行第二次冷冻。这将会是费力的操作。
【发明内容】
[0011] 描述了用于制备从先前冷冻保存的细胞汇集的冷冻保存的肝细胞的方法。所述方 法的新颖部分在于，解冻、汇集和重新冷冻保存肝细胞，但不包括先对冷冻保存培养基进行 稀释，然后通过等密度（iso-density)离心富集活细胞的传统操作。
[0012] 采用该新方法，将先前冷冻保存的分离自个体供者的肝细胞贮存在液氮或维持在 约-150摄氏度（°C)的冰柜中。为制备汇集自多个供者的冷冻保存的肝细胞，使来自多个 个体供者的肝细胞在37°C水浴中解冻，仅至冰晶刚刚消失（此时解冻的溶液在约4°C下）。 使解冻的肝细胞保持在设定为约4°C的冰浴中。将来自多个供者的肝细胞一起放（汇集） 至冰浴中的容器内。在向该汇集物添加来自所有供者的肝细胞之后，将含有来自多个供者 的细胞的肝细胞悬液分配进入多个冷冻用小瓶中用于冷冻保存。将"汇集的"冷冻保存的 肝细胞贮存在液氮冰柜或维持在约_150°C的冰柜中。可使冷冻保存的"汇集的"肝细胞解 冻并用于采用传统操作的实验。
[0013] 在一个总体方面，用于制备冷冻保存的人肝细胞的方法由如下要点组成：来自多 个个体而未经离心的肝细胞包含来自多个个体肝脏的冷冻保存的肝细胞，其位于对应所 述多个个体各自的分开器皿内的肝细胞悬液中；使所述来自多个个体的肝细胞的器皿在 37°C水浴中解冻直至所述肝细胞悬液达到约4°C的温度，仅至所述肝细胞悬液中的冰晶刚 刚消失的程度；将多个器皿的来自多个个体的肝细胞汇集在容器中，使肝细胞悬液的温度 维持在约4°C的温度；将汇集的肝细胞分配至多个器皿；和，冷冻保存所述多个汇集肝细胞 的器皿，而不稀释或更换肝细胞悬液。
[0014] 实施方式可包括如下特征中的一种或多种。例如，肝细胞悬液可包含冷冻保护剂， 例如，Dulbecco改良型伊格尔培养基：补充有10%胎牛血清和10%二甲亚砜（DMSO)的营 养混合物F-12(DMEM/F12)培养基。分离的肝细胞可来自多个个体的肝脏。
[0015] 所述肝细胞的冷冻保存可包括以约-l°c /分钟的速率降低温度至约-70°c。冷冻 保存的汇集的肝细胞可被贮存在例如，约-150°C或更低温度下的冷冻贮存系统中。所述冷 冻保存的汇集的肝细胞可在后期解冻用于实验。
【附图说明】
[0016] 图1是将冷冻保存的来自不同个体供者的肝细胞解冻并汇集，和分配所述汇集的 肝细胞以供冷冻保存的新方法的示意图。
【具体实施方式】
[0017] 发明人已开发出一种用于制备冷冻保存的汇集自多个供体的人肝细胞的改进方 法。该方法涉及来自多个个体的肝细胞的分离和冷冻保存。将分离并冷冻保存的肝细胞贮 存在冷冻保存库中。在从多个个体收集肝细胞之后，采用该改进的方法使所述肝细胞解冻、 汇集并重新冷冻保存。
[0018] 该改进方法的要素在于，在37°C快速解冻肝细胞以最小化冰晶形成和伴随的细胞 损伤，使解冻的肝细胞保持在约4°C，在约4°C下汇集来自多个个体供者的肝细胞，将汇集 的肝细胞分配至多个供于冷冻保存的容器（"冷冻用小瓶（cryoviain中，以及冷冻保存。 该新方法避免了稀释冷冻保存物、通过等张密度梯度离心以富集活细胞、在冷冻保存物中 重悬细胞沉淀物、汇集来自多个供体的肝细胞、分配汇集的肝细胞至冷冻用小瓶中和重新 冷冻保存的多重、费力和损伤性步骤。
[0019] 在人体内时，肝脏细胞（肝细胞）是发生药物代谢的细胞。