/生物合成纳米银复合材料的红外光谱图。从图中可以看出，葡萄籽提取物在3429.HcnT1处有较强的吸收峰，这是-OH伸缩振动的结果，2928.6和2855.29cm—1处吸收峰是由于-CH伸缩振动的结果，1613.67和1524.1lcnT1处吸收峰由苯环伸缩振动产生，而在1380-1450CHT1区间内的吸收峰则是由于脂族中-CHjP -CH3伸缩振动产生的。在氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料中，-OH的伸缩振动峰由3429.HcnT1变为3440.44cm - CH的伸缩振动峰由2928.66,2855.29CHT1 变为 2926.96cm 2852.35CHT1，苯环的伸缩振动峰由 1613.67CHT1 变为1625.71CHT1，在1380-1450(31^1区间内依然存在脂族中_012和_013的伸缩振动峰。这是由于在形成AgNPs时，游离的羟基以及其他基团使得化合物与银表面发生相互作用的结果，这为增强AgNPs的稳定性提供了保障。
[0043](5)抑菌实验
[0044]I) LB培养基的制备
[0045]LB液体培养基的配制:酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，超纯水定容至100mL,用IM的NaOH调节pH值至7.2 ；LB固体培养基的制备是在上述制备的培养液中再添加入1.5-2%的琼脂。以上两种培养基均置于高压灭菌锅内经120°C，0.1MPa高压灭菌20min，灭好菌的液体培养基冷却至室温，放置于4°C冰箱中保存；固体培养基则于未凝固时分装于培养皿中，冷却至室温，放置于4°C冰箱中保存。LB培养基供临床病原菌大肠杆菌和金色葡萄球菌培养之用。
[0046]2) 2216E培养基的制备
[0047]2216E液体培养基的配制:蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高铁0.0lg，陈海水定容至lOOOmL，用IM的NaOH调节pH值至7.6-7.8 ；2216E固体培养基的制备是在上述制备的培养液的基础上，添加1.5-2%的琼脂。以上两种培养基均置于高压灭菌锅内经120°C，0.1MPa高压灭菌20min，灭好菌的液体培养基冷却至室温，放置于4°C冰箱中保存；固体培养基则于未凝固时分装于培养皿中，冷却至室温，放置于4°C冰箱中保存。2216E培养基供海洋水产病原菌鳗弧菌和溶藻弧菌培养之用。
[0048]3)抑菌圈实验
[0049]供试临床病原菌采用LB培养基，37°C培养；供试海洋水产病原菌采用2216E培养基，28°C培养。采用琼脂扩散法检测活性物质的抑菌活性:将指示菌50 μ L加到5mL液体培养基中，200rpm震荡8?10h，培养至对数增长期，菌液用生理盐水稀释至106CFU/mL，分别取100 μ L均匀涂布于固体培养基上，然后在培养基上放置牛津杯(杯外径8mm)，杯中加入加入实施例1中合成的活性物质30 μ L，用生理盐水做阴性对照，做三次重复。将培养平皿在恒温培养箱中培养18h后观察，测量抑菌圈直径，取平均值，判断纳米银的抑菌活性。
[0050]4)菌落生长实验
[0051]将培养至对数增长期的大肠杆菌菌液稀释成106cFU/mL，加入实施例1中合成的活性物质使终浓度为?ο μ g/mL，以加生理盐水组为对照，37°C，200rpm震荡培养8h后分别取培养液100 μ L均匀涂布于LB固体培养基上，将培养平皿在37°C恒温培养箱中培养18h后观察菌落形成情况。
[0052]5)动力学实验
[0053]将培养至对数增长期的大肠杆菌菌液稀释成106CFU/mL，加入实施例1中合成的活性物质使终浓度分别为10、20 μ g/mL作为两个实验组，以加生理盐水组为对照，每隔0、10、30、60、120、18011^11取样，测定60011111处的OD值，绘制动力学曲线。
[0054]氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料和生物合成纳米银对供试病原菌的抑菌圈实验如图5所示。图中I为氧化石墨烯/生物合成纳米银；2为生物合成纳米银；3为葡萄籽提取液；4为氧化石墨烯。由图5可以看出，复合材料和生物合成纳米银具有显著的抑菌效果，而合成的原料葡萄籽提取液和氧化石墨烯不具有抑菌作用。并且复合材料与单纯生物合成的纳米银相比较具有更大的抑菌效果。这是因为银纳米颗粒负载在氧化石墨烯表面，使纳米银具有更大的比表面积，并且防止了银纳米粒子的团聚，大大提高了银纳米颗粒的稳定性。实施例1中合成的活性物质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌和溶藻弧菌的抑菌圈平均直径分别为14.33mm、11.83mm、13.82mm和11.07mm。
[0055]以大肠杆菌为指示菌，氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料对菌落生长的影响如图6所示，左侧图为生理盐水处理的对照组，培养平皿上长满了大肠杆菌菌落，显示有大量大肠杆菌生长；而右侧图为氧化石墨烯/生物合成纳米银复合材料处理组，涂布的平皿上则无菌落生成，说明该材料对大肠杆菌菌落生长有明显的抑制作用。
[0056]氧化石墨烯/纳米银抑菌复合材料处理大肠杆菌的生长动力学曲线如图7所示。培养液在600nm下的OD值与培养液中细菌生长的浓度呈正相关，OD值越高代表培养液中细菌的浓度越高，生长速度越快。由图7可以看出10 μ g/mL和20 μ g/mL的生物活性物质均对大肠杆菌产生明显的抑制作用，随着培养时间的延长，处理组菌液的OD值几乎没有发生变化；而加生理盐水对照组中的菌液随着培养时间的延长，OD值不断增长。体现了实施例I中抑菌复合材料优良的抑菌效果。
[0057]实施例2
[0058]取收集的葡萄籽，用自来水洗净，置于烘箱中，55°C干燥30分钟，得到干净的葡萄籽。用分析天平称取1.0OOOg葡萄籽，加入30mL超纯水(葡萄籽的质量和水的体积之比为1:30)，在110°C恒温下磁力搅拌4小时。将制得的溶液进行抽滤，得到葡萄籽提取液。另取286 μ L氧化石墨稀溶液(1.4mg/mL)加入16.7mL超纯水中，得到氧化石墨稀分散液，取2mL0.0lM的硝酸银溶液加入上述水溶液中，将ImL葡萄籽提取液加入上述混合液中。在96°C恒温下磁力搅拌，反应15分钟，即得到氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料。抑菌试验测定方法同实施例1，实施例2中合成的活性物质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌和溶藻弧菌的抑菌圈平均直径分别为13.92mm、11.17mm、12.60mm和10.65mm。
[0059]通过抑菌圈实验可以看出实施例1和实施例2所合成的活性物质均对供试病原菌有明显的抑制作用，实施例2所合成的复合材料的抑菌活性较实施例1合成的要高。
【主权项】
1.一种氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料的制备方法，其特征是:包括以下步骤: 1)取收集的葡萄籽，用水洗净，置于烘箱中，55°c干燥30分钟，得到干净的葡萄籽； 2)用分析天平称取1.0000g葡萄籽，加入20-30 mL超纯水，在110-120°C恒温下磁力搅拌2-4小时； 3)将制得的溶液进行抽滤，得到葡萄籽提取液； 4)将氧化石墨烯加入去离子水中，超声分散，得到氧化石墨烯的分散溶液； 5)取硝酸银加入氧化石墨烯溶液中，获得硝酸银/氧化石墨烯混合液； 6)取葡萄籽提取液加入硝酸银/氧化石墨烯混合液中； 7)上述混合溶液在90-96?恒温下磁力搅拌，反应15-20分钟，即得到氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料。
2.根据权利要求1所述的氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料的制备方法，其特征是:步骤4)中所述氧化石墨稀分散溶液的终浓度为0.0200 - 0.0300 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料的制备方法，其特征在于:步骤5)中加入的硝酸银的终浓度为1-2 mM。
4.根据权利要求1所述的氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料的制备方法，其特征是:步骤6)中加入的葡萄籽提取液的体积为1-2 mL，硝酸银/氧化石墨烯混合液的体积为 15-25mL。
5.一种由权利要求1-6任意一项所述的氧化石墨稀/生物合成纳米银抑菌复合材料的制备方法所得到的氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料。
【专利摘要】本发明公开了一种氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料的制备方法，包括制备葡萄籽提取液制备、硝酸银/氧化石墨烯混合液、将葡萄籽提取液加入硝酸银/氧化石墨烯混合液制备得到氧化石墨烯/生物合成纳米银抑菌复合材料等步骤。本发明充分利用葡萄籽这种废弃物，降低了生产成本，便于大量生产制备纳米银；生物合成的银纳米颗粒负载在氧化石墨烯片层结构上，有效防止了纳米银颗粒的团聚和氧化，大大提高了银纳米粒子的稳定性，并且提高了抑菌效果；反应是在水相中进行，反应条件温和，环境友好，操作简单，易于控制。
【IPC分类】A01N59-16, A01P1-00, A01P3-00, A01N25-08
【公开号】CN104855420
【申请号】CN201510188550
【发明人】王磊, 刘冲冲, 徐慧
【申请人】鲁东大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年4月20日