抗坏血酸在提高铝胁迫下植物硝态氮吸收中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于促进植物硝态氮吸收的植物生长调节剂领域，具体涉及抗坏血酸(ASA)促进铝胁迫下植物吸收硝态氮的新用途。
技术背景
[0002]销是地壳中含量最丰富的金属元素，其含量仅次于氧和娃，占总量的7.1%。在自然环境下，难溶性的硅酸盐或氧化铝是铝的主要存在形式，这种形式的铝对植物的生长发育和各种经济作物的产量都没有直接毒害作用。当土壤pH低于4.5时，土壤中的铝以Al3+离子态的形式释放出来，对作物造成危害。铝毒首先对作物根系产生毒害作用，影响植物对养分和水分吸收，干扰各种生理生化过程，同时使植物叶绿素含量下降，光合速率降低，直接影响植物干物质累积和产量形成。铝毒是酸性土壤影响植物生长的主要限制因子。全世界有大面积的酸性土壤，约占40%的世界耕地面积，主要分布在热带、亚热带和温带地区，大多数分布在发展中国家。在我国，酸性土壤主要分布在南方的大部分地区，约占耕地面积的21%。为了增加作物产量，人们对土壤进行集约管理，通过施用大量化肥来提高单位面积产量，使作物总产量增加，满足人口增加对粮食的需求。然而，大量的化学肥料施用使土壤pH下降，土壤酸化使土壤释放出大量的对植物具有毒性的三价铝离子，造成了很大的环境问题。
[0003]H2O2是活性氧(Active Oxygen Species, AOS)的一种，是细胞有氧代谢的产物。植物细胞能够通过非常多的代谢途径来产生H2O2，特别是在逆境胁迫下(干旱胁迫、盐胁迫、重金属胁迫等)会通过一些列的代谢活动产生大量的活性氧，如果这些扮演活性氧角色的H2O2不能够被及时清除，在细胞中累积过多，就会破坏生物大分子。植物体为了减少或者防止H2O2对自身所产生的毒害，体内形成了极其复杂的氧化应激机制。
[0004]硝态氮和铵态氮是植物吸收利用的两种主要矿质形态氮。旱地土壤硝态氮对于作物的前期供氮有着重要的作用，与植物氮素吸收量的相关性达到极显著水平，而铵态氮与植物氮素吸收量相关性很低。大量研宄表明，铝对植物氮素吸收具有抑制作用，铝干扰对N03_的吸收作用较NH4+严重。植物对NO 3_的吸收是个主动运输过程，一般认为细胞膜上存在N03_的专性载体，这种载体借助于质膜H+-ATPase建立的质子泵驱动力，在质膜H+-ATPase的作用下，ATP供能将H+泵出胞外(H+分泌和释放)，在H+形成的电势梯度下，伴随H+的同向运输NO 3'通过通道蛋白逆浓度梯度进入细胞内。吸收进入植物细胞内的Nor一部分被同化为氨基酸、蛋白质，或以氨基酸的形式运往地上部，另一部分N03_则被贮存在液泡中。因此，找到一种高效、低廉而又易于使用的提高植物在酸性土壤上吸收硝态氮的促进剂来解决铝胁迫抑制硝态氮吸收的问题具有重大的现实和应用意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种提高植物在铝胁迫下吸收硝态氮的增强剂，即抗坏血酸ASA在铝胁迫下提高植物对硝态氮吸收中的应用。
[0006]为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下:
(1)选择云南本地的铝敏感大豆SB(下称SB)、耐铝型大豆RB (下称RB)的饱满种子进行24小时过夜消毒，25°C黑暗下催芽萌发，待根长出2cm左右转入0.5mmol/L CaCl2溶液中平衡一天，再转移至1/4的Hoagland培养液培养一周，长出二叶后转移至Hoagland完全培养液培养；
(2)待SB、RB苗长到四对叶片时选择长势一致的健壮植株，分别在Hoagland培养液加不同铝浓度梯度(O、50、100、200、400 μ mo I.L—1) AlCl3梯度浓度胁迫处理24h后，取样进行硝态氮吸收和体内H2O2含量的测定；
(3)用浓度为2mmol/L的ASA和100μ mo I.L—1的AlCl 3浓度处理铝敏感型(SB)和抗铝型(RB)大豆幼苗，24h后取样进行硝态氮吸收以及各项生理生活指标测定。
[0007]本发明提供的抗坏血酸ASA作为植物在铝胁迫下对硝态氮吸收的调节剂，使用方便，成本较低。该调节剂显著提高了植物对硝态氮的吸收能力，开辟了用调节剂提高植物对营养元素吸收的新途径，有助于研宄水体富营养化治理的科学工作者提供解决的新思路，同时也为设施农业栽培，尤其是有利于土壤酸化引起阻碍植物硝态吸收问题解决提供科学依据。此方法无论是在农业还是环境治理领域都显得切实可行。
[0008]本发明的有益效果:本发明所述的铝胁迫下ASA作为植物吸收硝态氮的增强剂，具有投入低、操作简单、效率高的特点。常温下，ASA是比较理想的植物吸收硝态氮的增强剂，ASA处理可以减少在不同铝浓度胁迫下大豆叶片细胞内H2O2积累，增强植物根系对硝态氮的吸收，提高细胞膜上H+-泵活性，以及提高质膜H+-ATPase磷酸化水平、14-3-3蛋白表达水平等，在不同铝胁迫的大豆，通过ASA处理，不仅能够减缓了植株受到的铝胁迫作用，同时叶增加了氮吸收相关酶的活性，提高了大豆对硝态氮的吸收和利用，从而提高大豆的生长，对提高大豆的经济效益具有重要意义。
【附图说明】
[0009]图1是本发明中不同浓度ASA处理SB、RB幼苗24h的H2O2含量(A图)和叶片净光合作用速率(B图)的变化；
图2本发明中不同铝浓度胁迫处理下I天，SB、RB幼苗对硝态氮吸收情况；
图3是本发明中100 mM铝胁迫I天，添加ASA或不添加ASA大豆SB (A图)、RB (B图)幼苗根和叶片中H2O2的测定结果，其中CK为不添加ASA和AlCl 3溶液；
图4是本发明中不同浓度铝胁迫处理I天，添加ASA或不添加ASA大豆SB幼苗对硝态氮吸收情况，其中CK为不添加ASA ；
图5是本发明中100 mM铝胁迫I天，添加ASA或不添加ASA大豆SB幼苗叶片中的H+ATPase活性(A图)、氢泵活性(B图)测定结果，其中CK为不添加ASA ；
图6是本发明中100 mM铝胁迫I天，添加ASA或不添加ASA大豆SB幼苗根中的H+ATPase活性(A图)、氢泵活性(B图)测定结果，其中CK为不添加ASA ；
图7是本发明中100 mM铝胁迫I天，添加ASA或不添加ASA (CK)大豆SB幼苗根和叶片中的质膜ATP酶磷酸化水平(A图)、14-3-3蛋白表达水平(B图)检测结果，其中CK为不添加ASA。
【具体实施方式】
[0010]下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂。
[0011]实施例1:SB、RB植株的栽培和处理，步骤如下:
1、实验材料为SB、RB幼苗
SB、RB种子消毒催芽后，25°C黑暗下催芽萌发，待根长出2cm转入0.5mmol/L CaCl2S液中平衡一天，再转移至1/4的Hoagland培养液一周，长出二叶后转移至Hoagland完全培养液培养，待幼苗长至四对叶时用于本实验；
2、配置不同浓度(0、0.5、1、2、5、10 mmoI/L)的ASA处理液，配置不同浓度(50、100、200,400 μ mo I.Γ1)的 AlCl3 处理液；
3、分别用浓度0、0.5、1、2、5、10 mmol/L的ASA处理液处理SB、RB幼苗24小时，取样进行H2O2含量、净光合作用速率的测定；
4、分别用不同浓度(50、100、200、400μπιο1.L-1MlCl3铝溶液处理RB和SB幼苗，以AlCl3浓度为O的Hoagland培养液培养为空白对照，处理24小时后取样进行硝态氮吸收和H2O2含量的测定，每个处理设置三个重复；实验期间，Hoagland培养液ρΗ4.5，昼夜气温变化在13-22°C，光照和黑暗处理时间设定为12h/12h ；
5、用浓度为2mmol/L 的 ASA 处理浓度梯度为(0,50,100,200,400 μ mo I.L-1) AlCl3铝溶液下的铝敏感型(SB)和抗铝型(RB)大豆幼苗，以AlCl3浓度和ASA浓度均为O的Hoagland’ s培养液培养的SB幼苗为空白对照，处理24小时；取样进行硝态氮吸收和H2O2含量测定；
6、用浓度为2mmol/L的ASA处理10ymol吨_11(:13浓度胁迫下的铝敏感型(SB)大豆幼苗，以AlCl3浓度和ASA浓度均为O的Hoagland’s培养液培养的SB幼苗为空白对照，处理24小时，取样进行相关酶活和蛋白表达水平检测。
[0012]实施例2:采用实施例1中第3步处理后的SB、RB叶片进行H 202含量及光合作用速率测定
UH2O2含量测定:采用二甲酚橙法。称取新鲜植物叶片，按照材料与提取剂1:1的比例加入预冷丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管于12000g、4°C下离心20min，弃去残澄，上清即为样品提取液。分别用ddH20配制试剂A (内含3.3 mmol/L FeSO4, 3.3 mmol/L (NH4 )2S04，412.5 mmol/L H2SO4)和试剂 B (内含 165 μ mol/L 二甲酚橙，165 mmol/L 山梨醇)，使用前试剂A和试剂B按照1:10的比例混合构成工作试剂。此工作试剂与H2O2待测液按照2:1的比例混合，30°C水浴显色30min，于560nm处测定OD值，计算H2O2含量(图1A)0
[0013]2、叶片净光合作用速率测定:选取实施例1第3步中处理了 I小时的植物，从下往上数第三、四叶片测定其净光合速率。叶片净光合作用速率采用北京理仪科技有限公司Yaxin-1lOl植物光合仪进行测定，光合作用的测定在9: 00?10: 00进行。
[0014]从图1A可以看出，用不同浓度的ASA处理24小时后，SB、RB大豆叶片的H2O2含量和未用ASA处理的植株相比均有不同程度的减少；2 mmol/L ASA处理组H2O2含量减少最多，ASA浓度再升高，H2O2含量不再有明显变化。
[0015]从图1B看，不同浓度ASA处理SB、RB大豆叶片净光合速率有不同程度的恢复，但2 mmol/L ASA浓度处理时叶片净光合作用